Madame Lelica

Die SSF-Konzept

Die Idee zur Durchführung der enzymatischen Hydrolyse und fermentation gleichzeitig wurde vorgeschlagen, von Gauss, et al. in einem patent von 1976 ., Die Autoren gaben an, dass die Glukoseausbeute in einer traditionellen separaten enzymatischen Hydrolyse (unter Verwendung von Enzymen, die vom Pilz Trichoderma reesei produziert werden) niedrig war, wahrscheinlich aufgrund der Hemmung des Endprodukts der Hydrolyse durch Glukose und Cellobiose. Die Autoren konnten jedoch zeigen, dass sie bei Verwendung von SSF eine höhere Gesamtethanolausbeute erzielten, was sie auf die Entfernung von Glukose und Cellobiose durch die Fermentation und die daraus resultierende Freisetzung von Endprodukthemmung zurückführten., Der Begriff SSF (die Abkürzung SSF wird oft auch für die Festkörperfermentation verwendet) wurde von den Autoren zu dieser Zeit nicht verwendet, wurde jedoch innerhalb weniger Jahre nach der ursprünglichen Erfindung zur allgemeinen Notation für diesen Prozess. Die Vermeidung von Endprodukthemmung ist immer noch wahrscheinlich der wichtigste Grund für die Verwendung von SSF, aber es gibt mehrere zusätzliche potenzielle Vorteile. Gauss und Kollegen erwähnten zum Beispiel den Vorteil, dass Glukose nach einem separaten enzymatischen Hydrolyseschritt nicht von der Lignin-Fraktion getrennt werden muss, wodurch ein potenzieller Zuckerverlust vermieden wird., Darüber hinaus verringert die Kombination von Hydrolyse und Fermentation die Anzahl der benötigten Gefäße und damit die Investitionskosten. Der Rückgang der Kapitalinvestitionen wurde auf mehr als 20% geschätzt. Dies ist sehr wichtig, da die Kapitalkosten mit den Rohstoffkosten bei der Ethanolproduktion aus Lignocellulose vergleichbar sind . Andere Vorteile in Bezug auf den gleichzeitigen Verzehr von Pentose-und Hexose-Zuckern und die Entgiftung sind in jüngerer Zeit offensichtlich geworden, wie später in dieser Übersicht besprochen wird.,

Unvermeidlich gibt es auch Nachteile von SSF im Vergleich zum separaten Hydrolyse-und Fermentationsprozess (SHF). Die optimale Temperatur für die enzymatische Hydrolyse ist typischerweise höher als die der Fermentation – zumindest wenn Hefe als fermentierender Organismus verwendet wird. Bei einem SHF-Verfahren kann die Temperatur für die enzymatische Hydrolyse unabhängig von der Fermentationstemperatur optimiert werden, wohingegen bei einem SSF-Verfahren ein Kompromiss gefunden werden muss. Darüber hinaus kann die Hefe in einem SSF-Prozess aufgrund der Probleme der Trennung der Hefe vom Lignin nach der Fermentation nicht wiederverwendet werden., Daher stellt die Hefe notwendigerweise einen Ertragsverlust in einem SSF-Prozess dar, wenn die Hefe innerhalb des Prozesses aus Kohlenhydraten hergestellt wird (siehe Abbildung 1) oder wenn sie extern zugeführt wird. Die Enzyme sind ebenso schwer wiederzuverwenden, auch in einem SHF-Prozess. Die Enzyme werden entweder innerhalb des Prozesses produziert – siehe Abbildung 1) – was einen Substratverlust darstellt-oder extern zugeführt und erhöhen dadurch die chemischen Kosten., Die Rezirkulation von Enzymen ist ebenso schwierig, da die Enzyme an das Substrat binden, obwohl eine teilweise Desorption nach Zugabe von Tensiden erhalten werden kann .

Die Verfügbarkeit von lignocellulose-Rohstoffen variiert je nach geografischer Lage (siehe z.B., Kim und Dale ), und die Lignocellulose-Vorräte sind sowohl hinsichtlich der Struktur als auch der chemischen Zusammensetzung ziemlich heterogen (siehe Tabelle 1). Diese Heterogenität hat einen starken Einfluss auf das Prozessdesign und beeinflusst praktisch alle Prozessschritte, d.h. die mechanische Handhabung des Materials, Vorbehandlungsbedingungen, Auswahl von Enzymen und Hefestämmen sowie Trennung und Eigenschaften des verbleibenden Lignin. Dies wird in der folgenden Diskussion deutlich.,

Vorbehandlung

Ziel der Vorbehandlung ist es, die Lignocellulose-Struktur zu verändern und die Rate der enzymatischen Hydrolyse hauptsächlich der Cellulose zu erhöhen. Dies sollte mit einer minimalen Bildung von Verbindungen erfolgen, die die fermentierenden Mikroorganismen hemmen . Die zugängliche Oberfläche gilt als einer der wichtigsten Faktoren, die die Wirksamkeit des enzymatischen Zelluloseabbaus beeinflussen ., In nativem Holz ist nur ein kleiner Teil der Zellwandkapillaren für die Enzyme zugänglich . Die Vorbehandlung vergrößert jedoch die verfügbare Fläche auf verschiedene Arten ; i) es bilden sich Fragmente und Risse , die eine vergrößerte Fläche ergeben , ii) die Hemicellulosefraktion wird hydrolysiert, was die Abschirmwirkung verringert, iii) das Lignin unterliegt auch strukturellen Veränderungen und das Holz wird je nach Vorbehandlungstechnologie in unterschiedlichem Maße abgegrenzt . Somit kann die Abschirmung von Mikrofibrillen und das Verschließen von Poren, verursacht durch Lignin, entfernt werden., Andere Faktoren, von denen angenommen wird, dass sie die Verdaulichkeit in SSF beeinflussen, sind die Substratkristallinität und der Polymerisationsgrad (DP) .

Die Vorbehandlungsmethoden können in physikalische und chemische Methoden unterteilt werden, und Kombinationen dieser beiden werden häufig verwendet (siehe z. B. die von Mosier et al. ). Die Art des Ausgangsmaterials beeinflusst stark die Wahl der Vorbehandlungsmethode. Die Hemicellulose ist beispielsweise in hohem Maße in xylanreichen Materialien acetyliert., Da Acetat während der Hydrolyse freigesetzt wird, ist die Vorbehandlung dieser Materialien zum Teil autokatalytisch und erfordert weniger zugesetzte Säure und mildere Prozessbedingungen. Das freigesetzte Acetat trägt jedoch zur Toxizität der Hemicellulosehydrolysate bei.

Die Vorbehandlung mit Ammoniakfaser / Gefrierpulver (AFEX) gilt als attraktives Verfahren zur Vorbehandlung landwirtschaftlicher Rückstände mit hochverdaulicher Cellulose . AFEX depolymerisiert das Lignin, entfernt die Hemicellulose und entkristallisiert die Cellulose ., Die moderate Temperatur und der pH-Wert minimieren auch die Bildung von Zuckerabbauprodukten. Das Verfahren leidet jedoch unter hohen Kosten der Ammoniak – und Ammoniakrückgewinnung . In diesem Zusammenhang sollte auch die Kalkmethode auf der Basis von Calcium (oder Natrium) – Hydroxid erwähnt werden. Alkalivorbehandlungen werden bei niedrigeren Temperaturen für lange Verweilzeiten durchgeführt, und bei der AFEX-Methode wird eine Delignifikation der Biomasse erhalten.

Dampfexplosion ist eine intensiv untersuchte Vorbehandlungsmethode ., Die Auswirkungen von unkatalysierten Dampfexplosionen – und flüssigen Heißwasservorbehandlungen-auf die Biomasse werden hauptsächlich auf die Entfernung von Hemicellulose zurückgeführt. Durch Zugabe eines Säurekatalysators kann die Hydrolyse weiter verbessert werden . Verdünnte Säurevorbehandlungen mit H2SO4 oder SO2 sind aufgrund ihrer Wirksamkeit und Kostengünstigkeit die am häufigsten untersuchten Vorbehandlungsmethoden. Diese Methoden wurden in Pilotanlagen angewendet und stehen daher kurz vor der Kommerzialisierung . Die säurekatalysierte Behandlung verbessert die Hemicelluloseentfernung, führt zu einer teilweisen Hydrolyse von Cellulose und verändert die Lignin-Struktur ., Die Hauptnachteile hängen mit den Anforderungen an die Prozessausrüstung und der Inhibitorbildung zusammen . Bisher waren erfolgreiche Vorbehandlungen mit Alkali, AFEX und flüssigem Heißwasser auf landwirtschaftliche Rückstände und krautige Kulturen beschränkt , während säurekatalysierte Dampfvorbehandlungen aus diesen Materialien sowie aus Weichholzfuttermitteln hohe Zuckererträge erzielt haben .

Eine einfache Quantifizierung der Härte eines Dampfvorbehandlungsprozesses ist der sogenannte Schweregradfaktor log(R0)., This factor combines the time and the temperature of a process into a single entity, R 0 = t ⋅ e T r − 100 14.75 MathType@MTEF@5@5@+=feaafiart1ev1aaatCvAUfKttLearuWrP9MDH5MBPbIqV92AaeXatLxBI9gBaebbnrfifHhDYfgasaacPC6xNi=xH8viVGI8Gi=hEeeu0xXdbba9frFj0xb9qqpG0dXdb9aspeI8k8fiI+fsY=rqGqVepae9pg0db9vqaiVgFr0xfr=xfr=xc9adbaqaaeGaciGaaiaabeqaaeqabiWaaaGcbaGaemOuai1aaSbaaSqaaiabicdaWaqabaGccqGH9aqpcqWG0baDcqGHflY1cqWGLbqzdaahaaWcbeqcfayaamaalaaabaGaemivaq1aaSbaaeaacqWGYbGCaeqaaiabgkHiTiabigdaXiabicdaWiabicdaWaqaaiabigdaXiabisda0iabc6caUiabiEda3iabiwda1aaaaaaaaa@403B@ ., Für säurekatalysierte Vorbehandlungen wird manchmal der kombinierte Schweregradfaktor log (CS) verwendet. Dies berücksichtigt auch den pH-Wert, log (CS) = log(R0) – pH, und typische Werte für die säurekatalysierte Dampfexplosionsvorbehandlung von Weichholz liegen im Bereich von 2 bis 4 .

Optimale Vorbehandlungsbedingungen in einem SSF-Verfahren unterscheiden sich nicht notwendigerweise stark von denen eines SHF-Verfahrens unter Verwendung von Lignocellulose-Biomasse. Mehrere in Vorbehandlungshydrolysaten vorhandene Verbindungen, die die enzymatische Hydrolyse hemmen, werden jedoch von den fermentierenden Organismen umgewandelt., Dies ist eine wahrscheinliche Erklärung für die höheren gemeldeten Ethanolerträge in SSF im Vergleich zu SHF . Die Inhibitorbildung aus der Vorbehandlung kann daher in einem SSF-Verfahren in höherem Maße toleriert werden. Inhibitorische Verbindungen können in drei Hauptgruppen eingeteilt werden; Furaldehyde, schwache Säuren und Phenole. Die beiden häufigsten Furaldehyde, HMF (5-Hydroxymethyl-2-Furaldehyd) und Furfural (2-Furaldehyd), werden bei schweren Erkrankungen aus Hexosen bzw., Schwache Säuren aus Lignocellulose-Materialien wie Essigsäure, Ameisensäure und Levulinsäure werden hauptsächlich durch Deacetylierung von Hemicellulose oder HMF-Abbau gebildet . Phenolische Verbindungen werden hauptsächlich während des Lignin-Abbaus gebildet und sind je nach Art des Lignin in zahlreichen Varianten zu finden . Eine eingehendere Diskussion zur Hemmung finden Sie z. B. in der Rezension von Almeida et al .

Enzymatische Hydrolyse

Eine erfolgreiche Vorbehandlung hat die Hemicellulose weitgehend entfernt, so dass die Cellulose zur Hydrolyse zur Verfügung steht., Da die am häufigsten verwendeten Mikroorganismen zur Ethanolherstellung ausschließlich Zuckermonomere verwenden, muss die Cellulose hydrolysiert werden, was in einem SSF gleichzeitig mit der Fermentation erfolgt. Historisch gesehen wurde die industrielle Celluloseverdauung mit Säurehydrolyse und Optimierung der Säurehydrolyse verschiedener Lignocellulose-Materialien für ethanolproduzierende Zwecke durchgeführt ., Die Säurehydrolyse erzeugt jedoch Hydrolysate, die für die fermentierenden Mikroorganismen relativ giftig sind, und die maximale Glukoseausbeute ist in einem Chargenverfahren aus kinetischen Gründen auf etwa 60% begrenzt . Der enzymatische Abbau der Cellulosefraktion hat dagegen das Potenzial, relativ ungiftige Hydrolysate mit höheren Zuckererträgen zu ergeben.

Enzyme, die auf den Abbau des β spezialisiert sind-1-4-glykosidische Bindungen von Glucan werden gemeinsam Cellulasen genannt. 1950 präsentierten Reese et al. ein Modell der enzymatischen Cellulosehydrolyse auf Basis mehrerer Enzyme (C1 und CX)., Es wurde angenommen, dass das C1-Enzym kürzere Polyanhydro-Glucose-Ketten produziert, während die Solubilisierung dem CX-Enzym zugeschrieben wurde. Grundsätzlich gilt heute das gleiche Bild, aber das Wissen über die verschiedenen spezifischen Enzymkomponenten hat enorme Fortschritte gemacht. Die Cellulasen sind in drei Unterkategorien unterteilt, die drei Arten von Aktivität darstellen: Endoglucanasen, Exoglucanasen (Cellobiohydrolasen) und β-Glucosidasen., Endoglucanasen reduzieren den Polymerisationsgrad des Substrats signifikant, indem sie die Innenteile, hauptsächlich in den amorphen Bereichen der Cellulose, zufällig angreifen. Exoglucanasen (oder Cellobiohydrolasen) verkürzen hingegen schrittweise die Glucan-Moleküle, indem sie an die Glucan-Enden binden und hauptsächlich Cellobiose-Einheiten freisetzen. Schließlich spalten β-Glucosidasen das Disaccharid Cellobiose in zwei Einheiten Glucose.,

Verschiedene Arten von Mikroorganismen können Cellulasesysteme produzieren, darunter aerobe filamentöse Pilze, aerobe Actinomyceten, anaerobe hyperthermophile Bakterien und anaerobe Pilze (siehe z. B. Überprüfung durch Lynd et al. ). Intensive Forschung an den aeroben filamentösen Pilzen T. reesei in den letzten Jahrzehnten hat zu einem effizienten Cellulase produzierenden Organismus geführt, der derzeit die industrielle Cellulase-Produktion dominiert .

Wie bereits erwähnt, ist ein wichtiger Vorteil von SSF gegenüber SHF die Reduktion der Endprodukthemmung durch bei der Hydrolyse gebildete Zucker., Das Fermentationsprodukt Ethanol hemmt auch die Hydrolyse, jedoch in geringerem Maße als Cellobiose oder Glukose . Ein weiterer Vorteil ist, dass Inhibitoren aus der Vorbehandlung durch die Mikroorganismen metabolisiert werden können . Allerdings kann auch der SSF-Prozess an einer unvollständigen Hydrolyse der festen Lignocellulosefraktion leiden. Mit Ausnahme der Hemmung durch Endprodukte oder andere Komponenten kann dies auf Enzymdeaktivierung, unproduktive Enzymadsorption , abnehmende Verfügbarkeit von Kettenenden und zunehmende Kristallinität bei Umwandlung von vorbehandelter Cellulose zurückzuführen sein .,

In einem industriellen SSF sollten Enzym-und Zellkonzentrationen angemessen ausgeglichen werden, um die Kosten für die Hefe-und Enzymproduktion zu minimieren. Synergien zwischen den Enzymen, z. B. Endo-Exo-Synergismus, Exo-Exo-Synergismus und Synergismus zwischen Endo – oder Exoglucanasen und β-Glucosidasen , sollten ebenfalls durch Abstimmung der Zusammensetzung der Enzymmischungen optimiert werden. Die optimale Zusammensetzung hängt mit Sicherheit vom Lignocellulose-Rohstoff ab.,

Fermentierende Mikroorganismen

Allgemeine Anforderungen an einen Organismus zur Ethanolherstellung sind, dass er eine hohe Ethanolausbeute, eine hohe Produktivität und hohe Ethanolkonzentrationen aushalten sollte, um die Destillationskosten niedrig zu halten . Zusätzlich zu diesen allgemeinen Anforderungen sind Inhibitortoleranz, Temperaturtoleranz und die Fähigkeit, mehrere Zucker zu verwenden, für SSF-Anwendungen unerlässlich. Die Toleranz gegenüber niedrigen pH-Werten minimiert das Kontaminationsrisiko., Das Arbeitspferd bei der Stärke – oder saccharosebasierten Ethanolproduktion ist die übliche Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae. Dieser Organismus produziert Ethanol mit einer hohen Ausbeute (höher als 0,45 g g-1 bei optimalen Bedingungen) und einer hohen spezifischen Rate (bis zu 1,3 g g-1 Zellmasse h-1 ). Es hat auch eine sehr hohe Ethanoltoleranz, über 100 g L-1 wurde für einige Stämme und Medien berichtet . Darüber hinaus hat sich der Organismus gegenüber anderen Inhibitoren als robust erwiesen und eignet sich daher zur Fermentation von Lignocellulose-Materialien .,

Hemicellulose aus Hartholz und landwirtschaftlichen Rückständen ist typischerweise reich an Xylanen (vgl. Tabelle 1) – Hartholz, das hauptsächlich O-Acetyl-4-O-methyl-Glucuronoxylan enthält, während Gräser Arabinoxylan enthalten . Weichholz-Hemicellulose hingegen enthält mehr Mannane-hauptsächlich in Form von Galactoglucomannan – und weniger Xylan. Mannose Fermentation ist in der Regel effizient in S., cerevisiae, während die Fähigkeit, Galactose zu fermentieren, stammabhängig ist und die Gene für die Galactose-Verwertung weiterhin durch Glukose unterdrückt werden , was zu einer typischen sequentiellen Verwertung der Zucker führt. Die Xylose-Fermentation ist eindeutig ein wichtigeres Problem für landwirtschaftliche Rückstände und Hartholz als für Weichholz. Xylose wird nicht durch Wildtyp S. cerevisiae metabolisiert, abgesehen von einer geringfügigen Reduktion auf Xylitol. Dies und für einige Teile die Temperaturtoleranz waren der Hauptgrund für das Interesse, auch andere Mikroorganismen auf Lignocellulose-Umwandlung in SSF zu testen.,

Natürlich Xylose-fermentierende Hefen , wie Pichia stipitis und Candida shehatae, könnten potenziell vorteilhaft sein, in SSF von Materialien mit hohem Xylangehalt zu verwenden. Ihre Toleranz gegenüber inhibitorischen Verbindungen in nicht entgifteten Lignocellulosehydrolysaten ist jedoch eher gering, und zusätzlich ist eine sehr geringe und gut kontrollierte Sauerstoffversorgung für eine effiziente Xylose-Fermentation erforderlich . Die wichtigsten „Konkurrenten“ der Hefe waren die Bakterien Zymomonas mobilis und gentechnisch veränderte Escherichia coli. Z., mobilis, ein obligat anaerobes Bakterium, dem ein funktionelles System zur oxidativen Phosphorylierung fehlt, produziert Ethanol und Kohlendioxid als Hauptfermentationsprodukte. Interessanterweise nutzt Z. mobilis den Entner-Duodoroff-Weg, der eine geringere ATP-Produktion pro katabolisierter Glukose ergibt . Dies wiederum ergibt einen geringeren Biomasseertrag und eine höhere Ethanolausbeute an Glukose im Vergleich zu S. cerevisiae . Allerdings fehlt Wildtyp Z. mobilis die Fähigkeit, Pentose Zucker zu fermentieren, und ein großer Nachteil ist darüber hinaus, dass es nicht ein sehr robuster Organismus ist., Im Allgemeinen scheinen Bakterien gegenüber Lignocellulose-abgeleiteten Inhibitoren weniger tolerant zu sein, und vor der Fermentation kann ein Entgiftungsschritt erforderlich sein. Im Gegensatz zu Bäckerhefe und Z. mobilis ist E. coli in der Lage, eine Vielzahl von Substraten (einschließlich Hexosen, Pentosen und Laktose) zu metabolisieren, aber der Wildtyporganismus hat einen gemischten fermentativen Weg und ist somit ein schlechter Ethanolproduzent. In einem wegweisenden Beitrag, verliehen US-Patentnummer 5000000, ein Stamm von E., coli wurde genetisch in einen Ethanolproduzenten durch Überexpression von PDC (Codierung Pyruvat Decarboxylase) und adhB (Codierung Alkoholdehydrogenase) von Z. mobilis gentechnisch verändert . Hervorragende Ergebnisse wurden mit rekombinanten E. coli, z.B. dem KO11-Stamm, erzielt, die Ethanolausbeuten von 86 bis nahezu 100% der theoretischen und endgültigen Ethanolkonzentrationen von bis zu 40 g L-1 auf Hemicellulosehydrolysaten von Bagasse, Maisstover und Maisschalen gezeigt haben., In gemeldeten Studien wurde jedoch nur die flüssige Fraktion verwendet, und die Hydrolysate wurden vor der Verwendung weiter entgiftet, indem sie mit Calciumhydroxid auf pH 9 überzogen und dann mit HCl auf pH 6,0–6,5 eingestellt wurden. Darüber hinaus ist E. coli, da der optimale pH-Wert 6,5 beträgt, für SSF-Prozesse mit T. reesei-Cellulasen, die im Allgemeinen als pH-optimal um 4,8 angesehen werden, weniger geeignet .

Pentosegärung durch S. cerevisiae

Aufgrund der sehr attraktiven Eigenschaften von S., cerevisiae In industriellen Fermentationen wurden in den letzten Jahrzehnten erhebliche Anstrengungen unternommen, um rekombinante Xylose-und Arabinosegärungsstämme dieser Hefe zu entwickeln. Xylose-fermentierende Stämme von S. cerevisiae können prinzipiell entweder durch Einbringen von Genen , die für Xylose-Isomerase (XI) aus Bakterien und Pilzen kodieren, oder von Genen, die für Xylose-Reduktase (XR) und Xylitoldehydrogenase (XDH) aus Pilzen kodieren, konstruiert werden . Auch das endogene XKS1-Gen, das für Xylokinase (XK) kodiert, muss überexprimiert werden, um eine signifikante Xylose-Fermentation zu erhalten ., Transportproteine werden für die Aufnahme von Xylose sowie von anderen Zuckern in Hefe benötigt. In S. cerevisiae wurde festgestellt, dass Xylose von den Hexosetransportern transportiert wird, aber die Affinität für Xylose ist ungefähr 200-fach niedriger als für Glucose . Folglich wird die Xylose-Aufnahme kompetitiv durch Glukose gehemmt.

Es gibt 20 verschiedene Gene, die für zuckertransportbezogene Proteine kodieren, 18 einzelne Systeme (Hxt1-17 und Gal2) und zwei verwandte Signalproteine (Snf3p und Rgt2p)., Die Transporter weisen unterschiedliche Affinitäten für Zucker auf, und die Expression ihrer entsprechenden Gene wird durch die Zuckerkonzentrationen, d. H. Die Verfügbarkeit der Kohlenstoffquelle, reguliert . Es wurde zuvor vorgeschlagen, dass Xylose sowohl von hoch – als auch von niedrigaffinen Systemen von Glukosetransportern aufgenommen wird (Abbildung 2), aber die Aufnahme wird in Gegenwart niedriger Glukosekonzentrationen erhöht . Studien haben gezeigt, dass die hoch-und zwischenaffinen Hexosetransporter; Hxt4, Hxt5 Hxt7 und Gal2 sind in der Tat die wichtigsten Transporter für Xylose ., Weiterhin hat sich gezeigt, dass eine niedrige (aber nicht Null) Glukosekonzentration im Medium für eine effiziente Xylose-Aufnahme benötigt wird . Dies wurde durch einen Bedarf an Glukose für die Expression von glykolytischen Enzymen und Zwischenprodukten sowie die Erzeugung von Zwischenmetaboliten für die ersten Schritte des Xylose-Metabolismus und des Pentosephosphatwegs erklärt . Eine weitere mögliche Erklärung, die sowohl aus Experimenten als auch aus der Computermodellierung abgeleitet werden kann, ist, dass die Glukose für die Expression von Hexosetransportern mit günstigen Xylose-Transporteigenschaften benötigt wird, z. B. Hxt4 ., Um eine effiziente Co-Fermentation von Xylose und Glucose in SSF (manchmal als SSCF bezeichnet – gleichzeitige Verzuckerung und Co-Fermentation) mit rekombinantem S. cerevisiae zu erhalten, ist es daher erforderlich, die Glucosekonzentration niedrig zu halten, was in der Praxis in neueren SSF-Studien gezeigt wurde .