Madame Lelica

Es gibt vier Familien intrazellulärer proteolytischer Komplexe, die in Eubakterien allgegenwärtig sind: Lon, HslUV (ClpQY), ClpXP und FtsH. Zusätzlich zu diesen fünf ist HtrA (DegP) ein periplasmatischer/sezernierter proteolytischer Komplex, während das prokaryotische Proteasom nur in Actinomyceten vorkommt. Die Struktur, Funktion und Rolle in der Pathogenese jeder Protease wurde zuvor überprüft.,13, 17 Mehrere dieser Komplexe wurden als potenzielle antibakterielle Ziele untersucht, darunter Lon, 18 ClpXP, 19 HtrA20 und das Proteasom.21 Davon wurde ClpXP am umfangreichsten untersucht und ist der einzige Komplex, für den bisher natürliche Produktinhibitoren gefunden wurden.

Der clp proteolytic complex

ClpPs sind bei den meisten Bakterienarten gut konserviert und spielen eine wichtige Rolle beim Proteinumsatz., Neben der Proteinhomöostase und dem Abbau von fehlgefalteten Proteinen ist ClpP auch an zahlreichen Regulationsprozessen beteiligt, indem es auf Transkriptionsregulatoren und den Umbau des Proteoms abzielt.22, 23, 24, 25 Tatsächlich hat ClpP eine Schlüsselrolle bei der Regulierung von Prozessen wie Zellteilung, Stresstoleranz, Virulenz, morphologischer Differenzierung und Antibiotikaresistenz gespielt.22, 23, 24 Die Rolle von ClpP bei diesen Prozessen beruht auf seiner strengen Auswahl von Proteinsubstraten, die es erreicht, indem es den Zugang zu seinen katalytischen Stellen einschränkt., Jeder ClpP-Komplex wird durch Stapeln von zwei heptameren Ringen gebildet, um einen Tetradekamer zu erzeugen (Abbildung 2).26 Der gebildete Kanal beherbergt 14 serinproteasekatalytische Stellen, auf die ohne Durchgang durch die axialen Öffnungen nicht zugegriffen werden kann. Darüber hinaus nimmt apo-ClpP eine inaktive, komprimierte Konformation an, in der seine katalytische Triade falsch ausgerichtet ist.27 Kontrollierende konforme Aktivierung und Zugang zu axialen Öffnungen sind Hsp100-Proteine der AAA+ – Superfamilie von ATPasen: ClpA oder ClpX in gramnegativen Bakterien und ClpC oder ClpX in Grampositiven., Diese zusätzlichen ATPasen bilden hexamere Ringe, die die axialen Flächen des Tetradekamers mit Tripeptid (L/I) – GF-Motiven binden, die in hydrophobe Taschen passen.Die Bindung in dieser hydrophoben Tasche reguliert die ClpP-Aktivität auf zwei Arten: erstens durch Stabilisierung des Komplexes in einer aktiven, erweiterten Konformation mit der katalytischen Triade und zweitens durch Entfaltung des Proteinsubstrats., AAA+ ATPasen interagieren entweder direkt oder über ein kooperierendes Adapterprotein mit Proteinzielen und nutzen die von ATP bereitgestellte Energie, um das Substrat zu entfalten und es in die zentrale Pore einzuspeisen, wo es energieunabhängig hydrolysiert wird. Da gefaltete Proteine sonst zu groß sind, um in den Kanal einzudringen, regulieren diese AAA+ – Partner fest, welche Proteinsubstrate für die Degredation bestimmt sind.28

Die meisten Bakterienarten, einschließlich E. coli, Bacillus subtilis und Staphylococcus aureus, haben ein clpP-Gen, das zusammen mit ihren assoziierten AAA+ – ATPasen für die Lebensfähigkeit der Zellen nicht essentiell ist.25, 29, 30, 31, 32 Dennoch wurde beobachtet, dass die clpP-Deletion bei diesen Arten ihre Anfälligkeit für Antibiotika wie Linezolid und Rifampicin erhöht und die Virulenz bei Krankheitserregern wie Listeria monocytogenes und S. aureus verringert.,23, 33 Der Verlust der Virulenz bei ClpXP-defizienten Stämmen wurde mit großen Störungen der globalen Virulenz-Transkriptionsfaktorniveaus wie dem sar/agr-Regulierungsnetzwerk in S. aureus in Verbindung gebracht.Interessanterweise scheint die Wirkung der ClpP-Inaktivierung auf mehrere dieser Virulenzregulatoren stammabhängig zu sein, und darüber hinaus scheinen einige S. aureus-Stämme, denen die ClpXP-Funktion fehlt, eine verminderte Anfälligkeit für Vancomycin -, Daptomycin-und β-Lactam-Antibiotika zu haben.,34, 35, 36

Im Gegensatz zu den meisten Bakterien finden sich zwei oder mehr Kopien von clpP in Aktinobakterien und Cyanobakterien, und mindestens eine Funktionskopie ist für die Lebensfähigkeit unerlässlich.37, 38 In Mycobacterium tuberculosis bilden clpP1 und clpP2 ein Operon und beide Gene sind essentiell. Diese Isoformen arbeiten zusammen, um eine funktionelle Protease zu erzeugen, indem sie ClpP1-und ClpP2-Homoheptamer in einen Heterotetradecamer stapeln.37, 39 Der vier AAA+ ATPasen in M. tuberculosis, ClpX und ClpC1 sind für die Lebensfähigkeit unerlässlich.,40, 41

Aufgrund seiner Rolle bei der Lebensfähigkeit und Virulenz von Zellen ist das ClpP-System ein vielversprechendes Ziel für neuartige antibakterielle Mittel mit drei möglichen Mechanismen zur Deregulierung (Abbildung 2): Hemmung der ClpP-Proteolyse, Aktivierung der ClpP-Proteolyse oder Störung von Partner-AAA+ – ATPasen.

ClpP-Inhibitoren

Der vielleicht offensichtlichste Ansatz zur Targeting des ClpP-Systems ist die Entwicklung eines aktiven Site-Inhibitors von ClpP. Der Nachweis des Prinzips dieser Wirkungsweise wurde bei S. aureus, Streptococcus pneumoniae und L nachgewiesen., monocytogene, bei denen clpP-Knockouts keine Hautinfektionsabszesse, Lungeninfektionen oder In-vivo-Makrophagen-Parasitismus verursachen können.22, 42, 43 Dieser Verlust der Virulenz wurde mit einer verminderten Aktivität von extrazellulären Proteasen, Lipasen, DNasen und α-Hämolysin in S. aureus und α-Listerolysin und listerielle Phospholipase in L. monocytogenes assoziiert.

Die Pionierarbeit von Böttcher und Sieber44, ClpP gezielt anzusprechen, führte zur Entwicklung einer Reihe von β-Lacton-Inhibitoren., Inspiriert von der Reaktivität von β-Lactonen in der Natur synthetisierten sie eine Bibliothek von Alkin-markierten Derivaten (z. B. Lacton D3; Abbildung 3a), die gegen mehrere bakterielle Proteome gescreent wurden. Der Click-Chemie, die auf der Alkin-tag wurde verwendet, um zu befestigen verknüpft und erlauben die Identifizierung von reaktiven Enzyme. Auf diese Weise wurde ClpP als hochspezifisches Ziel identifiziert, das ein kovalentes Addukt zwischen seinen aktiven Stellen-Seren und dem β-Lacton bildet und dadurch die proteolytische Aktivität irreversibel hemmt (Abbildung 3b).,Die nachfolgende Charakterisierung zeigte die Fähigkeit von β-Lactonen, die Virulenzfaktoraktivität, einschließlich α-Hämolysin und Listerolysin, in S. aureus bzw.45, 46 Diese Verringerung der Virulenzfaktoren korrelierte mit der Fähigkeit optimierter β-Lactongerüste (U1; Abbildung 3a), die S. aureus-Infektion nach subkutaner Verabreichung in einem Hautabszessmodell und L. monocytogenes-Wachstum in Makrophagen signifikant zu reduzieren.46, 47 Darüber hinaus wurden β-Lactonderivate (Verbindung 7; Abbildung 3a) als eine der privilegierten Gruppen von Verbindungen gefunden, die in M eintreten können., tuberkulose um das Wachstum mit einem MIC von 28 µg ml−1,48 letztlich wirksam zu hemmen, schließt jedoch eine geringe Plasmastabilität aufgrund einer schnellen Hydrolyse des zyklischen Esters eine weitere klinische Entwicklung aus.

In jüngerer Zeit haben Sieber und Kollegen eine neue Klasse potenter ClpP-Inhibitoren, die Phenylester, entdeckt (AV170; Abbildung 3a). Phenylester, die unter Verwendung eines unvoreingenommenen Siebs von 137 000 synthetischen Verbindungen in einem fluorogenen Assay für die ClpP-Aktivität entdeckt wurden, wirken durch die gleiche kovalente Modifikation von Seren wie β-Lactone., Interessanterweise sind einige Enantiomere auch in der Lage, die Desoligomerisierung des ClpP-Tetradekamers in Heptamer auszulösen, eine günstige Wirkungsweise, da die Konformationskontrolle der serinkatalytischen Triade es in der heptameren Form von ClpP inaktiv macht. Trotz der verbesserten Wirksamkeit der Proteasehemmung der Phenylester gegenüber β-Lactonen ist ihre Antivirulenzaktivität reduziert, da sie nur die α-Hämolysin-Produktion verringern und nicht abschaffen können (Abbildung 3c). Bemühungen zur Potenzsteigerung zeigten einen Kompromiss zwischen Stabilität und Reaktivität.,49

Obwohl die ClpP-Hemmung als Wirkmechanismus vielversprechend ist, ist die Weiterentwicklung und Entdeckung neuartiger Gerüste eindeutig erforderlich. Angesichts der jüngsten Hinweise auf Arzneimittelresistenz bei bestimmten CLPP Knockout Stämmen, 34, 36 einige Vorsicht auf diesem Weg kann gerechtfertigt sein.

ClpP-Aktivatoren

Die Aktivierung des ClpP-Proteasesystems ist eine besonders interessante therapeutische Option. Ein Kennzeichen intrazellulärer Proteasen ist die strikte Regulierung der Aktivität, um einen Abbau des Zielproteins zu vermeiden. Bei Eukaryoten wird dies oft durch Kompartimentierung in Organellen erreicht., Im Gegensatz dazu haben Bakterien enge regulatorische Proteinkomplexe entwickelt, um die Proteaseaktivität zu kontrollieren. Durch die Aktivierung der proteolytischen Aktivität zum wahllosen Abbau von Proteinen könnte ein Medikament nicht nur bei den Arten, bei denen ClpP essentiell ist, sondern auch bei denen, bei denen ClpP entbehrlich ist, den Zelltod verursachen. Mutationen, die die Aktivität von ClpP abschaffen und theoretisch Resistenzen verleihen, wären in Zellen, in denen ClpP essentiell ist, tödlich und beeinträchtigen die Virulenz in Zellen, in denen ClpP entbehrlich ist., Schließlich kann die beispiellose Wirkungsweise durch Aktivierung und nicht durch Hemmung ihres Ziels es ermöglichen, dass ein solches Medikament gegen ruhende persistierende Zellen wirksam ist.

Serendipitärer Prinzipienbeweis dieses einzigartigen Wirkungsmechanismus wurde mit der Entdeckung von Acyldepsipeptiden berichtet (ADEPs; Abbildung 4a). ADEPs wurden erstmals 1985 in einem Patent als „A54556-Komplex“ beschrieben, eine Gruppe von acht eng verwandten Verbindungen, die von Streptomyces hawaiiensis NRRL15010.50 ClpP hergestellt wurden, wurde 2005 als molekulares Ziel von ADEP identifiziert, als Brötz-Oesterhelt et al.,51 wendete Reverse genomics auf einen ADEP-resistenten E. coli-Stamm an, um die Resistenzdeterminante als Mutation in ClpP zu identifizieren, die sie inaktiv macht. Dieser Befund deutete darauf hin, dass ADEPs ClpP aktivieren und einen unangemessenen Proteinabbau verursachen. Tatsächlich bestätigten In-vitro-Studien, die die Spaltung fluorogener Peptide messen, und In-vivo-Proteomanalysen, dass ADEP-aktiviertes B. subtilis ClpP in der Lage war, Proteine unabhängig von AAA+ – Regulation oder ATP-Hydrolyse abzubauen.,51

Einblicke in diesen Regulationsverlust gewähren Kristallstrukturen von ADEP-aktiviertem ClpP von E. coli, B. subtilis, M. tuberculosis und Neisseria meningitidis (Abbildung 4b).52, 53, 54, 55 bindet ein ADEP-Molekül an jedes Monomer im ClpP-Tetradekamer in derselben hydrophoben Tasche, die von den AAA+ – ATPasen verwendet wird, und hemmt so deren Wechselwirkung (Abbildung 4d).,52, 55, 56 Die Bindung ahmt die Konformationskontrolle der ATPase von ClpP nach, induziert die Ausrichtung der serinkatalytischen Triade und eine starre Körperrotation der ClpP-Monomere, wodurch die axiale Pore in E. coli von 10-12 Å auf 20 Å erweitert wird.27, 52, 55 Ein Gating-Mechanismus wird auch von den N-Terminal-Domänen bereitgestellt, die sich von einer Down-oder Closed-Konformation zu einer Up-oder Open-Konformation auf ADEP-Bindung bewegen.,52, 55 Die ADEP-Aktivierung erlaubt es nicht, stabil gefaltete Proteine abzubauen, da sie noch zu groß sind, um in das axiale Lumen von ClpP einzudringen, sondern ermöglicht es, instabile Proteine und entstehende Ketten, die aus dem Ribosom austreten, abzubauen, insbesondere wenn sie sich langsam falten.Es wird angenommen, dass der Zelltod ein Ergebnis dieses wahllosen Abbaus sowie der Hemmung der normalen ClpP-Funktion ist.

ADEPs wirkt gegen eine Reihe grampositiver Bakterien, darunter klinisch relevante Methicillin-resistente S. aureus (MRSA), Vancomycin-resistente Enterokokken und Penicillin-resistente S., pneumoniae sowie die gramnegativen Erreger N. meningitidis und Neisseria gonorrheae.51, 54 Halbsynthetische ADEP-Derivate sind gegen Enterococcus faecalis, S. aureus und S. pneumoniae in Maus-und Rattenmodellen wirksam,wobei die Aktivität Linezolid, 51 und die Aktivität gegen MRSA in einem murinen Periotinitis-Modell Vancomycin überlegen ist.58 Insbesondere entwickelt sich bei diesen Bakterienarten eine Resistenz gegen ADEPs mit einer Häufigkeit von bis zu 10-6 durch Mutationen, die die Funktion von ClpP verringern, was nicht wesentlich ist., Es wurde jedoch gezeigt, dass Kombinationstherapien mit ADEP und Rifampicin unter Verwendung der verminderten Fitness von clpP-Mutanten eine Vancomycin-resistente MRSA-Population in vitro vollständig ausrotten.59

Noch vielversprechender ist die Fähigkeit von ADEPs, persistierende Zellen zu eliminieren.59 Conlon et al.59 beschrieben zuerst diese Eigenschaft, wenn ein ADEP effektiv tötete sowohl stationäre Phase S. aureus und persister S. aureus links nach Ciprofloxacin Behandlung. Dieser Befund hat Auswirkungen auf die Verwendung von ADEPs gegen latente Tuberkuloseinfektionen, die durch arzneimitteltolerante M. tuberculosis-Persistente verursacht werden., Bis heute wurde die Aktivität gegen M. tuberculosis persisters nicht beschrieben, aber es wurde gezeigt, dass ADEPs das Wachstum von M. tuberculosis verlangsamt, wenn es mit zwei Effluxpumpenhemmern, Reserpin und Verapamil, kombiniert wird.39

Obwohl ADEPs vielversprechende Leads für Arzneimittelkandidaten sind, weisen sie ungünstige pharmakologische Eigenschaften auf, einschließlich schlechter Wasserlöslichkeit, schneller systemischer Clearance und chemischer Instabilität.51, 60 Nach der Entdeckung der Wirkungsweise von ADEP wurde von der Bayer AG ein SAR-Programm für medizinische Chemie gestartet, um ein stabileres und wirksameres Derivat von ADEP zu entwickeln., Diese Bemühungen führten zur Entwicklung von ADEP4, einem hochwirksamen ADEP1-Derivat mit drei wichtigen Modifikationen: Phe wird durch 3,5-Difluorphenylalanin ersetzt, von dem angenommen wird, dass es H-Bindungen mit ClpP bildet,Das Acylpolyen wird durch einen α -, β-ungesättigten Hexenoylschwanz ersetzt, um die Stabilität zu verbessern, und N-MeAla wird durch Pipecolat ersetzt, was die Steifigkeit von ADEP erhöht.Die Aktivität von ADEP4 wurde von Carney et al. weiter verbessert.61 durch Ersetzen von Ser durch Allo-Thr und Pip durch 4-MePip, um ADEP weiter zu verschärfen., Durch die Quantifizierung der Wasserstoff-Deuterium-Wechselkurse mit 1H NMR wurde gezeigt, dass die Steifigkeit des ADEP-Moleküls die transannulären H-Bindungen verstärkt und dadurch die entropischen Kosten der Bindung an ClpP reduziert. Carneys ADEP-Derivat hat eine 600-1200-fach höhere Wirksamkeit als ADEP1 gegen grampositive Krankheitserreger.61

Trotz der erhöhten Wirksamkeit dieser ADEP-Derivate haben sie nur eine begrenzte Aktivität gegen gramnegative Bakterien und werden durch aktiven Ausfluss, insbesondere bei M. tuberculosis, effizient aus der Zelle entfernt.,39, 62 Zahlreiche andere Bemühungen der synthetischen Chemie haben Motive untersucht, um diese Einschränkungen zu überwinden, aber die meisten haben zu einer verminderten Aktivität geführt (Abbildung 4c).54, 63, 64, 65, 66, 67 Angesichts der intimen Bindung von ADEP in seiner hydrophoben Tasche ist dieses Ergebnis vielleicht vorhersehbar und deutet darauf hin, dass Änderungen am ADEP-Gerüst eine Sackgasse erreicht haben könnten.

Zur Identifizierung neuartiger ClpP-Aktivatoren wurden zwei Bildschirme mit hohem Durchsatz montiert.65, 68 Beide identifizierten niedermolekulare Aktivatoren von E., coli-ClpP durch Verwendung eines In–vitro-Assays zur Messung von Fluoreszenzsteigerungen, die durch Spaltung von Fluoresceinisothiocyanat-Casein, einem Modellsubstrat für ClpP, verursacht werden. In der ersten, Leung et al.65 untersuchten 60 000 arzneimittelähnliche synthetische Chemikalien und identifizierten fünf Verbindungen, die als ACP1–5 bezeichnet werden (Abbildung 4a). Die aktivsten dieser Verbindungen waren 10-20-fach weniger potent als ADEP1 bei Aktivierung von ClpP und zeigten selbst in Gegenwart von Permeabilisierungsmitteln nur eine bescheidene antibakterielle Aktivität. Lavey et al.,68 untersuchte stattdessen >20 450 Pilz-und Bakterienextrakte oder Metaboliten und identifizierte einen einzelnen ClpP-Aktivator, Sclerotiamid (Abbildung 4a). Dieses Paraherquamid-verwandte Indolinon war 73-fach weniger wirksam als ADEP1 bei Aktivierung von EcClpP und konnte das Wachstum von Efflux-defizienten E. coli oder Pseudomonas aeruginosa nicht hemmen.

Trotz der begrenzten Wirksamkeit von ACPs und Sclerotiamid bieten diese Studien neuartige Gerüste für die Derivatisierung und öffnen die Tür für zukünftige Studien zur Identifizierung von ClpP-Aktivatoren., Man könnte sich zum Beispiel vorstellen, alternative Aktivierungsbindungsstellen auf ClpP zu identifizieren. Die ClpP-Regulation beinhaltet nicht nur die Kontrolle des Substrateintritts durch Porenbreite bei AAA+ ATPase-Assoziation, sondern auch die Bildung der serinkatalytischen Stelle durch Oligomerisierung zu Tetradekamern.69 Vielleicht könnte ein kleines Molekül, das unter Beibehaltung von ClpP als Heptamer die Bildung einer aktiven Stelle induzierte, einen einfachen Zugang zu dieser aktiven Stelle durch wahllose Substrate ermöglichen.,

AAA+ ATPase-Entkoppler als Therapeutika

Da ClpP bei der Auswahl und Entfaltung von Proteinsubstraten auf AAA+ ATPasen angewiesen ist, können Störungen dieser Partner auch das ClpP-proteolytische System deregulieren. Dies gilt insbesondere für M. tuberculosis, wo die ClpC1-und ClpX-ATPasen für die Lebensfähigkeit der Zellen essentiell sind.40, 41 Tatsächlich wurde jede der drei Verbindungen, die auf ClpC1 abzielen, die bisher charakterisiert wurden, durch Screening von Naturproduktextrakten auf Anti-M. Tuberkulose-Aktivität entdeckt., Das erste zu entdeckende ist Cyclomarin A (cymA), ein zyklisches Heptapeptid, das vom marinen Bakterium Streptomyces sp. CNB-982 (Abbildung 5a).70 Obwohl es 1999 als starkes entzündungshemmendes Mittel mit Zytotoxizität gegen Krebszellen beschrieben wurde, wurde erst 2011 eine Aktivität gegen M. tuberculosis während eines Naturprodukts entdeckt ganzzelliges Screen.71 In einem ersten Versuch zu identifizieren cymA das molekulare Ziel, ein reverse-genomics-Ansatz aufgenommen wurde. Allerdings ohne spontanen Widerstand., tuberkulose-Mutanten konnten wiederhergestellt werden, stattdessen wurde die Affinitätschromatographie verwendet, um zu zeigen, dass cymA auf ClpC1 mit hoher Spezifität abzielt. Die anschließende Kokristallisation von cymA mit der N-terminalen Domäne von ClpC1 identifizierte Rückstände, die für die Bindung wichtig waren, und ermöglichte trotz der Unfähigkeit, spontane resistente Mutanten zu erzeugen, die ClpC1-Mutanten, die Resistenz gegen cymA verleihen, erzeugten.72

ecumicin, ein makrozyklisches Tridecapeptid von Nonomuraea sp., MJM5123, 73 und Lassomycin, ein 16-gliedriges Lasso-Peptid von Lentzea kentuckyensis sp., 74 wurden beide durch Screening von Rohaktinomycetenextrakten isoliert (Abbildung 5a). Die N-terminale Domäne von ClpC1 wurde als molekulares Ziel dieser Verbindungen durch umgekehrte Genomik an spontanen resistenten Mutanten identifiziert. Obwohl cymA, Ecumicin und Lassomycin ein gemeinsames Ziel haben, legen die strukturelle Charakterisierung und die Position von Mutationen, die jeder Verbindung Resistenz verleihen, nahe, dass jede Verbindung an einer etwas anderen Position auf der N-terminalen Domäne von ClpC1 bindet (Abbildung 5b)., Im Gegensatz zu cymA und Ecumicin ist Lassomycin beispielsweise hochgradig basisch, enthält mehrere Arg-Rückstände und dockt in einer stark sauren Region von ClpC1.74

CymA, Ecumicin und Lassomycin sind alle bakterizid gegen die Replikation von M. tuberculosis, einer Reihe anderer Mykobakterienarten und multiresistente M. tuberculosis. Wichtig ist, dass sie auch gegen nicht komplizierende M. tuberculosis aktiv sind. In Übereinstimmung mit dem Mangel an Essentialität von AAA+ ATPasen fehlt jeder Aktivität gegen andere grampositive und gramnegative Arten wie S. aureus und P. aeruginosa., Diese Spezifität hat Vorteile, da ihnen auch die Aktivität gegen entsprechende Mitglieder der menschlichen Mikrobiota fehlt.

Um den Zelltod bei M. tuberculosis zu verursachen, scheinen Ecumicin und Lassomycin die ATPase-Aktivität zu stimulieren, sie jedoch vom Proteinabbau abzukoppeln.73, 74 Auf diese Weise wird der Abbau natürlicher Substrate gehemmt und führt zu deren Aufbau und Toxizität, ähnlich den Wirkungen sowohl von ClpP-Inhibitoren als auch von Aktivatoren bei M. tuberculosis., Im Gegensatz zu Ecumicin und Lassomycin wurde vorgeschlagen, dass cymA den Proteinabbau erhöht, wie eine Abnahme der LeuAspAsp-Tripeptid-markierten grün fluoreszierenden Proteinfluoreszenz zeigt, die auf ClpC1 bei Inkubation mit cymA abzielt.71 Es ist jedoch möglich, dass diese Abnahme der Fluoreszenz das Ergebnis der Entfaltung von grün fluoreszierendem Protein durch ClpC1 und nicht durch Abbau ist, und cymA kann daher den gleichen Entkopplungsmechanismus wie Ecumicin und Lassomycin aufweisen., Es bleiben mehrere Fragen zum Wirkungsmechanismus dieser Arzneimittel unbeantwortet, einschließlich ihrer Auswirkungen auf die Proteinentfaltung und wie die Atpaseaktivität stimuliert und die Proteolyse beispielsweise durch Hemmung der Wechselwirkung mit ClpP1P2 gehemmt wird. Darüber hinaus ist die Charakterisierung für einen weiteren kürzlich entdeckten ClpC1-Inhibitor, das Rufomycin-Analogon RUF-I. 75

Trotz der relativ hohen Wirksamkeit von cymA, Ecumicin und Lassomycin gegen M. tuberculosis, noch im Gange Optimierung der pharmakologischen Eigenschaften ist erforderlich., Beispielsweise weist cymA bei Mäusen eine Leberclearance und eine kurze Halbwertszeit auf, und Ecumicin weist eine begrenzte Löslichkeit und eine schlechte Darmresorption auf.13, 73 Jüngste Gesamtsynthesen und Fermentationsoptimierung können bei diesen Entwicklungen helfen.76, 77, 78

Obwohl Medikamente, die auf ClpC1 abzielen, eine faszinierende Möglichkeit für Anti-M. tuberculosis-Therapeutika darstellen, haben sie im Allgemeinen keine bakterizide Aktivität gegen andere Arten als Aktinobakterien., Bei diesen Arten, bei denen ClpP und assoziierte AAA+ – ATPasen entbehrlich sind, ist es möglich, dass das Targeting auf diese ATPasen antivirale Wirkungen hat, die denen ähneln, die mit ClpP-Inhibitoren beobachtet wurden. Eine solche Verbindung müsste jedoch wahrscheinlich mehrere ATPase-Partner ansprechen können, um eine so weit verbreitete Wirkung wie eine direkte Wirkung auf ClpP zu erzielen. Diese potenziellen antiviralen Wirkungen wurden nicht auf cymA, Lassomycin oder Ecumicin untersucht.,

Erreichen der Spezifität

Der bakteriellen proteolytischen Komplexe, alle außer HslUV hat einen menschlichen Ortholog und viele sind in der Tat intensiv als potenzielle Antikrebsziele untersucht. Zum Beispiel spielen mitochondriale Proteasen LONP1, ClpXP und m-AAA (FtsH homolog) eine wichtige Rolle bei der Qualitätskontrolle in den Mitochondrien, insbesondere bei Atemstress.79 Mutationen in m-AAA sind auch an spastischer Querschnittslähmung, einer erblichen neurodegenerativen Erkrankung, beteiligt.80 Daher ist es wichtig, dass antimikrobielle Mittel spezifisch auf ihr bakterielles Homolog abzielen können.,

Bei Proteaseinhibitoren, die als Suizidsubstrate wirken sollen, kann das Erreichen einer Spezifität aufgrund konservierter katalytischer Mechanismen eine Herausforderung sein. In der Tat wurde ein Mangel an Spezifität bei den Bemühungen zur Entwicklung von Inhibitoren sowohl des prokaryotischen Proteasoms als auch der bakteriellen Lon-Protease festgestellt. Das prokaryotische Proteasom bei M. tuberculosis ist ein vielversprechendes Ziel für die Hemmung, da es für das Wachstum in vitro entbehrlich ist, aber für das Überleben von Stickoxidstressfaktoren und die Persistenz bei Mäusen unerlässlich ist.,62, 82 Es wurden viele Versuche unternommen, ein Medikament gegen das mykobakterielle Proteasom zu entwickeln, üblicherweise als Peptidylepoxyketone, Aldehyde oder Boronate, aber die meisten hemmen das Säugetierproteasom stärker als das von M. tuberculosis.Diese Selektivität ist jedoch nicht beispiellos, wie die Entdeckung der Oxathiazol-2-One-Verbindungen GL5 und HT1171 zeigt (Abbildung 6). Diese Verbindungen sind bakterizid gegen nicht replizierendes M., tuberkulose behandelt mit subinhibitorischen Niveaus von Stickoxide21 und haben >1000-fach erhöhte Aktivität gegen Mykobakterien über menschliche Proteasomen. Es wird angenommen, dass die Spezifität durch Wechselwirkung des Arzneimittels mit Resten außerhalb der aktiven Stelle verliehen wird, die in Säugetierproteasomen nicht konserviert sind.21

Lon ist auch ein vielversprechendes Ziel, da es an der Bildung von Biofilmen, Motilität und Belastungstoleranz beteiligt ist und Mutanten nachweislich eine verringerte Besiedlung und Virulenz bei Salmonella enterica serovar Typhimurium, Actinobacillus pleuropneuoniae, Vibrio cholera und P. aeruginosa aufweisen.84, 85, 86, 87 In dem bisher einzigen Versuch, bakterielle Lon-Inhibitoren zu identifizieren, wurden Proteasom-Inhibitoren in vitro gescreent und die Peptidylboronat-MG262 identifiziert.,18 Diese Verbindung ist jedoch immer noch 2000-fach stärker gegen das Proteasom der 20ER Jahre.18 Wie bei Oxathiazol-2-one-Verbindungen ist es wahrscheinlich erforderlich, Rückstände, die in menschlichen Homologen divergieren, zu nutzen, um einen hochspezifischen Lon-Inhibitor zu entwickeln.

Die Spezifität kann auch erreicht werden, indem man sich außerhalb der katalytisch aktiven Stelle zu Bindungsstellen bewegt, die die Proteasefunktion stören, aber zwischen menschlichen und bakteriellen Orthologen schlecht konserviert sind. ADEPs demonstrieren treffend das Potenzial dieses Ansatzes., Obwohl sie nicht direkt an menschlichem ClpP (hClpP) getestet wurden, sind ADEPs für menschliche Zellen bis zu 25 µg ml-1 ungiftig, was darauf hindeutet, dass sie eine schlechte Affinität zum menschlichen Enzym aufweisen.Der strukturelle Vergleich von E. coli (EcClpP) und hClpP unterstützt diesen Begriff. Ihre Rückgratstruktur ist weitgehend erhalten, mit einer mittleren Quadratabweichung von 0.,63 Å;88 Die Inspektion der für die ADEP-Bindung verwendeten hydrophoben Tasche zeigt jedoch, dass hClpP mehrere Substitutionen aufweist, die seine Hydrophobie verringern (Asn55Pro, His60Tyr und His112Phe), zusammen mit einer Ladungsinversion (Glu56Lys) am distalen Teil der Andocknut. Es ist durchaus möglich, dass diese Änderungen die ADEP-Bindung in hClpP verhindern. Es sollte jedoch beachtet werden, dass EcClpX, obwohl nicht EcClpA, hClpP aktivieren kann.88 In jedem Fall kann die Suche nach Medikamenten an weniger konservierten regulatorischen Stellen der Schlüssel zur Suche nach hochspezifischen antibakteriellen Mitteln sein.