Madame Lelica

Struktur af ACLY med CoA afslører produktive og uproduktive CoA protein

Vi produceret rekombinant, fuldlængde ACLY i Escherichia coli for, at alle vores biokemiske og strukturelle analyser (Extended Data Fig. 1a,b)., Differentiel scanning fluorimetri af en .ymet med forskellige cofaktorer bekræftede bindingen og potentielle strukturelle ændringer forbundet med ligander tilsat alene eller i kombination (udvidede Data fig. 1c). Vi brugte disse data til at styre strukturbestemmelsen af ACLY med dets co-substrater eller co-produkter.

Vi forberedte det rekombinante protein og udførte oprindeligt negativ plet-enkeltpartikelanalyse af proteinet i fravær af metabolitter (ACLY-apo)., De todimensionale (2D) klassegennemsnit fra 3.000 partikler bekræftede, at proteinet dannede en tetramer (udvidede Data fig. 2a, B). For at få mere strukturelle detaljer udførte vi en cryo-EM–undersøgelse af ACLY-citrate-CoA-komplekset. Efter flere runder med optimering af cryo-EM-prøverne bestemte vi den D2 symmetriske cryo-EM–struktur af ACLY-citrate-CoA-strukturen til en gennemsnitlig samlet opløsning på 3.0 Å. (Udvidede Data Fig. 2c, d, 3 og 4 samt tabel 1).,

ACLY–citrat-CoA struktur danner en homotetramer med en central tetrameric CSH-modul og to ASKE domæner på modsatte ender af CSH-modul (protomers 1 & 2-og 3 – & 4) (Fig. 1a,b). ASKEDOMÆNET (rester 1-806) vedtager en struktur, der ligner den tidligere rapporterede α/β-arkitektur for det isolerede N-terminale domæne bundet til citrat og ADP24., CSH-domænet (rester 859-1101) består udelukkende af helices og korte sløjfer, med strukturel homologi til en dimer af citratsyntase dimerer, der krydser ved ~90° vinkler (udvidede Data fig. 5a). Aske-og CSH-domænerne i hver polypeptidkæde er forbundet med et stort set udvidet ~50-restspoleområde bortset fra en kort A-Heli.mellem rester 824 og 829. Den spiralformede region inden for denne linker er det eneste punkt med betydelig kontakt (ved van der .aals interaktion) mellem de to ASKEDOMÆNER på den ene side af molekylet., Den udvidede linker tillader CSH af en underenhed til at interagere med aske domæne af en anden underenhed på tværs af den modsatte side af CSH-modulet. I modsætning til de relativt sparsomme interaktioner mellem ASKEPROTOMERNE danner CSH-domænerne et omfattende netværk af overvejende van der .aals-interaktioner, der antyder, at CSH-domænerne fungerer som et stift tetramerisk modul, mens de fire ASKEDOMÆNER er mere fleksible. Dette stemmer overens med, at den observerede em-lokale opløsningsestimering på EM-kortet er højest på CSH-domænet (2.8 Å, udvidede Data fig., 4c) og vores tidligere observationer, at CSH-domænet har en højere smeltetemperatur i forhold til asken på ~75 versus C versus ~55.C, henholdsvis 21.

CoA binder ved grænsefladen mellem CSH-og ASH-domænerne i separate underenheder og ser ud til at ‘hæfte’ superdomænerne sammen. Adeninbasen og riboseringen interagerer med CSH-domænet for en monomer og den pantotheniske arm og β-mercapto-gruppen, der stikker ind i det aktive sted for ASKEDOMÆNET i en anden underenhed (fig. 1c (til venstre) og Fig. 1d (venstre))., Modellering af CoA er baseret på observationen af, at den phosphorylerede ADP-gruppe er godt løst i cryo-EM-densiteten. Mercapto-gruppen var imidlertid ikke godt løst, hvilket tyder på fleksibilitet i denne region. Selv om flere rester fra CSH og ASKE domæner gøre van der Waals-interaktioner med CoA, brint obligationer fra S574, R576 og S577 fra ASKE domæne og K964 fra CSH domæne til ribose fosfat oxygens ud til at spille en særlig vigtig rolle i at hæfte CoA på ASKE–CSH interface., Interessant nok er E599 inden for brintbindingsafstand til CoA ‘ s modellerede svovlatom, hvilket indebærer, at det kan spille en vigtig katalytisk rolle. Betydningen af protein-CoA-interaktionerne fra ASH-og CSH-domænet understøttes af mutationsfølsomheden af rester R576 og K964, og den potentielle katalytiske rolle af e599 understøttes af dens mutationsfølsomhed over for a eller., men ikke til D (Fig. 1f). Selvom citrat var inkluderet i prøven til cryo-EM-rekonstruktion, kunne det ikke med sikkerhed løses på cryo-EM-kortet.,

i betragtning af den uløste tæthed for mercapto–gruppen af CoA gennemførte vi en anden rekonstruktion af ACLY-citrate-CoA-strukturen uden at pålægge D2-symmetri for at bestemme, om CoA kunne vedtage forskellige konformationer i forskellige protomerer. Vi var i stand til at forberede en rekonstruktion uden at pålægge symmetri (C1, asymmetrisk lukket) til en nominel opløsning på 3, 5 Å. I denne ACLY–citrat-CoA-C1 asymmetrisk lukkede struktur, beslutningen omkring ASKE domæne er dårligere end i D2 struktur, men den lokale beslutning omkring CSH domænet fortsat er relativt høj, fra 2,8 til 3,2 Å., Analyse af denne acly-citrat-CoA-C1 asymmetriske lukkede struktur afslørede, at hvert af ASKEDOMÆNERNE og tre af de fire CSH-domæner og CoA-molekyler vedtog den samme konfiguration som D2-strukturen. Imidlertid vedtager en af CoA-molekylerne en alternativ konformation, hvor den phosphorylerede ADP-del forskydes ~8 Å mod CSH-modulet, og den pantotheniske arm bøjes over for at interagere med CSH (Fig. 1b, C (til højre) og Fig. 1e). Cryo-EM-densiteten svarende til denne alternative CoA-konformation er meget klar (fig. 1c (højre))., Det er bemærkelsesværdigt, at cryo-EM tæthed er også observeret for en velorganiseret vand molekyle, som synes at broen hydrogenbinding samspillet mellem terminalen svovl atom af CoA med den side, kæde rester af H900, D1026 og R1065 med yderligere van der Waals-interaktioner fra L969, I973, H975 og R976 (Fig. 1d (højre)). Samtidig med denne alternative CoA-konformation skifter en sløjfe inden for CSH-domænet (rester 965-986) og de flankerende helices for at imødekomme den alternative position af CoA-adeninbasen (fig. 1e)., Mutationer af h975, R976, D1026 og R1065 til alanin viser alle kompromitteret aktivitet, hvilket antyder, at bindingen af CoA til CSH-domænet på en eller anden måde er involveret i en .ymaktivitet (fig. 1f). I betragtning af, at CoA skal reagere med citrat i ASKE domæne, henviser vi til CoA konformationer med cysteamine af pantothenic arm, der peger i retning af ASKE og CSH som ‘produktive’ og ‘uproduktive’ CoA protein, henholdsvis forpligtet til at ACLY.,

Struktur ACLY–citrat-CoA delpopulation afslører asymmetrisk ASKE retningslinjer

I tillæg til de store ACLY–citrat-CoA partikel befolkning, svarende til 57% af klasse 3 partikler, en delpopulation af ACLY–citrat-CoA komplekse partikler, der repræsenterer 23% af den underklasse af partikler (10% i alt) også var fanget i en 3D-rekonstruktion uden at indføre symmetri til en opløsning på 4.3 Å (Extended Data Fig. 3)., Denne underpopulation af partikler har en samlet struktur, der ligner den største acly–citrate-CoA–population, bortset fra at et af de fire ASKEDOMÆNER roteres ~50.mod dets nærmeste ASKEUNDERENHED for at vedtage en mere ‘åben’ konformation, så vi henviser til det som ‘ACLY-citrate-CoA-C1 asymm open’. I denne struktur er densitet kun synlig for den phosphorylerede ADP-del af to CoA-molekyler bundet til to af de symmetriske ASKEDOMÆNER (fig. 2a, B). En af de symmetriske og asymmetriske aske underenheder viser ingen beviser for CoA binding., Det asymmetriske ASKEDOMÆNE forekommer især uforeneligt med produktiv CoA-binding (fig. 2c). Vi foreslår, at denne ACLY-citrate-CoA-C1 asymm åben struktur repræsenterer en mellemliggende tilstand af ACLY, hvor to aktive steder er primet til katalyse og to ikke. Observationen af denne struktur antyder også, at de fire aktive steder kan fungere uafhængigt.

Struktur ACLY-apo stat, der er ugunstige for CoA bindende

i Betragtning af det begrænsede samspil mellem CSH og ASKE domæner, vi spurgte om strukturen af ACLY i mangel af bundet ligander. For at gøre dette bestemte vi cryo-EM-strukturen af ACLY i apo-formen, som vi var i stand til at løse til 4.3-Å-opløsning (udvidede Data fig. 4a og tabel 1)., En sammenligning af de ACLY-apo og ACLY–citrat-CoA strukturer afslører, at, i det her land, at hver af ASKE par på modsatte ender af tetramer er drejet mod hinanden med ~10° for at danne et mere åbent ACLY tetramer, og at ASKEN domæner i positioner, der synes at unåde produktive CoA bindende (Fig. 3). Specifikt ville ASKESLØJFER centreret på F533, s574 og k1018 (fra det tilstødende CSH–domæne) kollidere med CoA som bundet i acly-citrate-CoA-strukturen (fig. 3b)., Derudover bevæger de to rester, der er inden for hydrogenbindingsafstand til CoA fra ASKEDOMÆNET R576 og E599, sig ud af hydrogenbindingsafstanden i ACLY-apo-strukturen (fig. 3c). I mellemtiden forbliver CSH-modulet stort set uændret mellem de to strukturer. Sammen, en sammenligning af acly-apo og ACLY–citrate-CoA strukturer afslører, at ACLY-apo struktur skal omarrangere at rumme CoA substrat.

ACLY–acetyl-CoA–åbent lufttrafikrum komplekse afslører CoA–citrat lyase reaktion forekommer i ASKE domæne

Differential scanning fluorimetry data viste, at både acetyl-CoA og åbent lufttrafikrum produkter stabiliseret ACLY protein (Extended Data Fig. 1c)., Denne konstatering indikerede, at vi kunne fange ACLY–OAA–acetyl-CoA-produktkomplekset, og så bedre forstå reaktionsmekanismen. Til dette formål bestemte vi kompleksets kryo-EM-struktur, som vi besluttede til 3.1-Å-opløsning ved hjælp af D2-symmetri (udvidede Data fig. 4). Den overordnede struktur af ACLY–co-produkt kompleks var mest ligner den symmetriske ACLY–co-substrat (ACLY–citrat-CoA-D2) kompleks, med en samlet root-mean-square deviation (r.m.s.d.) af 0.407 Å for Ca atomer (Fig. 4a)., Vi fandt, at acetyl-CoA besatte det samme bindingssted som CoA og også blev stabiliseret af de samme basiske rester, R576 og K964 (fig. 4b). Derudover var vi i stand til utvetydigt at modellere to OAA-molekyler bundet til hver ACLY underenhed (fig. 4b, c). Et OAA-molekyle (OAA1) overlapper med citratbindingslommen inden for ASKEDOMÆNET og proksimalt til acetylgruppen af acetyl-CoA. OAA1 gør relativt beskedne interaktioner med proteinet, herunder hydrogenbindinger til n346 og T348 og van der .aals interaktioner med F547., Det andet OAA-molekyle (OAA2) er bundet til CSH-domænet og gør mere omfattende interaktioner med ACLY end OAA1. OAA2 kontakter CSH-modul via hydrogenbindinger til H900, D1026, R1065 og R1085 og gennem van der Waals-interaktioner til at F935 og F1061 fra en enhed, såvel som gennem en hydrogenbinding at R1065 fra en anden enhed (Fig. 4c). OAA2 overlapper godt med bundet OAA i pig heart citrate synthase25 (udvidede Data Fig. 5b).

Vi også raffinerede cryo-EM kort over ACLY–åbent lufttrafikrum–acetyl-CoA struktur uden symmetri begrænsninger og opnåede en identisk struktur med D2-symmetri, bortset fra at den ene af de fire acetyl-CoA molekyler, der viste to mulige konformationer af pantothenic arm af acetyl-CoA, den ene med cysteamine af CoA mod ASKE domæne, som i de tre andre protomers, og den anden mod CSH domæne (Extended Data Fig. 6a)., I modsætning til den alternative konformation af CoA, der findes i ACLY–citrate-CoA-strukturen, ændrede positionen af den phosphorylerede ADP-gruppe imidlertid ikke i disse to konformationer. Den potentielle alternative konformation af acetyl-CoA kunne foreslå en mulig substratfrigivelsesvej i en .ymomsætning eller en autoinhibitorisk tilstand af en .ymet (beskrevet nedenfor).

observationen af oaa1-og acetyl-CoA-produkterne i ASKEDOMÆNET antydede stærkt, at lyasekemien udføres der,i modsætning til tidligere forslag om, at denne kemi udføres i CSH domain22, 23., Vi spekulere, at OAA2 kan virke til at hjælpe med at organisere de CSH domæne for samarbejdet med ASKE domæne og/eller optræde som en anden åbent lufttrafikrum produkt autoinhibitory websted, der kunne binde de pantothenic arm af acetyl-CoA (eller cysteamine af CoA) til at sætte sig på tværs af CSH domæne, sådan at de udelukker gensidigt bindende for CoA i en produktiv kropsbygning hæmmes ved høje cellulære åbent lufttrafikrum koncentrationer (Extended Data Fig. 6a)., Interessant nok kan den produktive udvidede CoA-orientering med cysteaminet, der peger mod ASKEDOMÆNET, ikke modelleres til ACLY-apo uden signifikant sterisk sammenstød (fig. 2b) kan den vippede orientering med cysteaminet peger mod CSH-domænet (udvidede Data fig. 6b). Dette er i overensstemmelse med vores fund, at CoA er i stand til at binde til ACLY i fravær af citrat og/eller ATP (data ikke vist), men vi foreslår en bøjet konformation, som observeret i en af acly–citrate-CoA-C1 protomerer (Fig. 1c (til højre) og Fig., 1d (til højre)) og også den isolerede struktur af CSH domain22.

i overensstemmelse med hypotesen om, at OAA2 kan fungere som et acly autoinhibitorisk sted, viste en tidligere undersøgelse, at OAA er i stand til at hæmme rottelever på en måde, der ikke er konkurrencedygtig med citrat26. For at validere den funktionelle betydning af de to åbent lufttrafikrum websteder, der er observeret i ACLY–åbent lufttrafikrum–acetyl-CoA struktur, har vi ansat en steady-state fluorescens-quenching eksperiment., Som en kontrol eksperiment, vi første titreret citrate i ACLY i tilstedeværelsen eller fraværet af en mætte koncentration af CoA og var i stand til at passe data til en citrate bindende site med Kd værdier på 3,4 ± 0.5 µM og 1,4 ± 0.3 µM i tilstedeværelsen eller fraværet af CoA, med god R2 værdier på 0,92 og 0.84, henholdsvis (Fig. 4d). Dette er i overensstemmelse med den ene citrate bindende site, der er observeret i ACLY ASKE domæne krystalstruktur, der er bundet til citrate13 og krystal struktur intakt ACLY bundet til CoA og citrate22, der viser, at CoA stabiliserer citrate bindende i ACLY ASKE domain22., Vi titrerede derefter OAA til ACLY og fandt, at dataene passede markant bedre til en to-site model (R2 = 0.99) end en one-site model (R2 = 0.93) (fig. 4e). De to-site bindende model bedre indpasses bifasisk fluorescens fald, der bliver synlige ved højere åbent lufttrafikrum koncentrationer og giver anledning til en høj affinitet åbent lufttrafikrum bindingssted (Kd = 15 ± 4 µM), der tegner sig for en tredjedel af den samlede fluorescens skift og en lav affinitet åbent lufttrafikrum bindingssted (Kd = 1,300 ± 500 µM), der tegner sig for de resterende to tredjedele af den samlede fluorescens ændre (Fig. 4e)., Disse data er i overensstemmelse med den funktionelle relevans af de to OAA–bindingssteder, der er observeret i ACLY–OAA-acetyl-CoA-strukturen.

ACLY-E599 er i stand til at fungere som en vigtig katalytisk rester

ACLY–co-produkt struktur tilladt os at rette en lang stående spørgsmål om ACLY molekylære mekanisme. ACLY foreslås, at kløver citryl-CoA mellemliggende ved hjælp af en generel base til at udtrække en proton fra citrate substrat og/eller en generel syre til reprotonate de åbent lufttrafikrum forlader group16,27,28., Dette er i overensstemmelse med en ph-hastighedsprofilanalyse af ACLY med en PKA på ~8.5 (fig. 5a). Vi antager, at den evolutionært konserverede E599 er placeret til at spille en vigtig katalytisk rolle som en generel base og/eller syre og/eller til stabilisering af phospho-citryl-CoA-mellemproduktet (se næste afsnit og Fig. 4b). En relativt høj PKA for en begravet glutamatrest er tidligere blevet noteret 29. I overensstemmelse med en vigtig katalytisk rolle for E599 fandt vi, at e599a-og E599. – mutanterne har signifikant kompromitteret aktivitet (fig. 1f), selv om cofaktorbindingen var upåvirket (Fig. 5b)., I modsætning hertil fandt vi, at en lignende sur e599d-mutant udviste lignende aktivitet som ACT ACLY (fig. 1f), med en tilsvarende ph-hastighedsprofil (fig. 5a). Samlet set argumenterer dataene for vigtigheden af E599 for katalyse af ACLY.

ACLY katalyse udbytte gennem en phospho-citryl-CoA mellemliggende i ASKE domæne

identifikation af E599 som en vigtig katalytisk rest for spaltning af citryl-CoA adduktet til acetyl-CoA og åbent lufttrafikrum produkter har givet os en mulighed for at fælde en reaktion mellemliggende af en ACLY-E599Q mutant i overværelse af ATP, citrat og CoA substrater., Derfor har vi blandet den ACLY-E599Q mutant med at mætte koncentrationer af ATP, citrat og CoA (ACLY-E599Q–ATP-citrat-CoA) og bestemt sin cryo-EM struktur, som vi var i stand til at løse en samlet beslutning af 2.85 Å. Den struktur blev fastlagt ved at pålægge D2 symmetri og afslørede, at den ASKE, og CSH domæner af ACLY var arrangeret på samme måde som den ACLY–citrat-CoA produkt og ACLY–åbent lufttrafikrum–acetyl-CoA strukturer med r.m.s.d. værdier for Ca atomer af 0.584 og 0.620 Å, hhv., Men i modsætning til disse andre substrat og produkt komplekser, den ACLY-E599Q–ATP-citrat-CoA komplekse afsløret bemærkelsesværdigt godt defineret cryo-EM tæthed i ASKE domæne aktivt site, der kunne modelleres som ADP (ATP hydrolyseres) og en phospho-citryl-CoA mellemliggende (Fig. 6a, b). Også, i modsætning til alle de andre ACLY strukturer, der er rapporteret i denne undersøgelse, amino syre 752-767 loop huse H760 rest, som har vist sig at mægle fosfat transport fra ATP citrat, er godt bestilt i ACLY-E599Q–ATP-citrat-CoA struktur (Fig. 6c)., Derudover observeres et magnesiumion-eller vandmolekyle, der også foreslås at stabilisere H760, at være bundet til E599 og fosfatgruppen (fig. 6c). Denne observation antyder, at his760-remanensen, phosphatgruppen og magnesiumionen kan samarbejde for at stabilisere citrat til ligering til CoA i ASKEDOMÆNETS aktive sted. Hertil kommer, at den omstændighed, at acetyl-CoA og åbent lufttrafikrum produkter er ikke observeret i denne struktur, der yderligere understøtter vores konklusioner, at E599 spiller en vigtig rolle som katalysator i spaltning af phospho-citryl-CoA mellemliggende til acetyl-CoA og åbent lufttrafikrum produkter inden for ASH domæne.,