materialer og metoder
mus.
vildtype C57BL / 6 mus blev opnået fra Charles River Laboratories (.ilmington, MA). PDE8A KO mus blev oprindeligt produceret af Deltagen, Inc. (San Carlos, CA) på kontrakt med PFI ,er, Inc. (PFI .er Global Research and Development, sand .ich, Storbritannien). De blev efterfølgende opdrættet til C57BL / 6 mus ved University of .ashington i 10 generationer. Til de rapporterede forsøg blev der anvendt aldersmatchede mus mellem 6 og 8 uger., Alle anvendte procedurer blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (Iacuc) fra University of .ashington i overensstemmelse med National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals.
Real-Time PCR.
Testis cDNA, der blev udarbejdet fra total RNA fra wild-type og PDE8A-null mus testis ved hjælp Hævet III og Oligo dT (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Real-Time PCR blev udført ved hjælp af Power SYBR green master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA)., Primere (IDT, Coralville, IA) for PDE8A, dirigeret til området nedstrøms rettet mod kassette, var som følger: frem primer, GCCACAGAAATGACGAAGC (exon 19); reverse primer, ATGTCTTCCAGACTTCTGTCAGG (exon 20). Primere for hypoxanthine-guanin phosphoribosyltransferase var som følger: frem primer ATTATGCCGAGGATTTGGAA; omvendt primer, CCCATCTCCTTCATGACATCT.
in Situ hybridisering.
skabelonen for riboprobe-syntese blev opnået ved PCR ved anvendelse af et plasmid indeholdende musen PDE8A-sekvens., I særdeleshed, 3′ – regionen af musen PDE8A (exons 17-20) blev forstærket ved hjælp af følgende primere: frem primer, AATTAACCCTCACTAAAGGACGGCGTATTTCCTTTCCAG (understreget T3 fag RNA-polymerase promotor sekvens); reverse primer, TAATACGACTCACTATAGGGACACGTCGGCACACTTAAT (understreget T7 fag RNA-polymerase promotor sekvens). PCR-produkterne blev isoleret fra agarosegeler og oprenset med et Gelekstraktionssæt (.iagen, Valencia, CA)., 35S-mærket riboprobes blev syntetiseret ved in vitro-transskription med en MAXIscript T3/T7 kit (Ambion, Austin, TX) ved hjælp af, som skabelon PCR-produkt, som indeholder T3 og T7 fag RNA-polymerase promotor sites. In vitro-transkription blev udført i en 20 µl-reaktionsblanding indeholdende 5 µl UTP (PerkinElmer, Boston, MA) og T3 RNA-polymerasen eller T7 RNA-polymerasen for at opnå henholdsvis sansen eller antisense-riboproben.testikler blev dissekeret fra vildtype-og PDE8A KO-mus og blev hurtigt frosset i væv – Tek O. C. T.-forbindelse (Sakura, Torrence, CA) på tøris., Sektioner (20 µm) blev skåret i en kryostat, monteret på en Superfrost plus microslide (VWR Videnskabelige, West Chester, PA), og luft tørret. Sektionerne blev fikseret i 4% paraformaldehyd i 15 minutter ved stuetemperatur, behandlet med 0,25% eddikesyreanhydrid i 0,1 M triethanolamin (pH 8,0) i 10 minutter og dehydreret gennem en graderet ethanolserie (30, 60, 80, 95 og 100%). Afsnittene blev derefter inkuberes med hybridiseringsbuffer i et fugtigt kammer ved 60°C i 4 timer. Efter skylning i 2× SSC (standard saltvand citrate; 1× SSC = 0,15 M natriumchlorid/0.015 M natriumcitrat, pH 7.,2) blev sektionerne dehydreret gennem en graderet ethanolserie. Hybridisering blev udført i buffer indeholdende 35S-mærket antisense-eller sense-sonde (40 pg/34,000–38,000 cpm pr. Den coverslips blev forsigtigt fjernet, og de sektioner, der blev vasket med 2× SSC indeholder 10 mM DTT-for 30 min to gange ved 60°C. sektioner blev derefter inkuberes i 30 minutter ved 37°C med 20 µg/ml RNaseA i 0,5 M NaCl, 10 mM Tris·HCl (pH 7.,5), og 1 mM EDTA, derefter vaskes i 50% formamid, 2× SSC indeholder 10 mM DTT-for 30 min ved 60°C i 1× SSC indeholder 10 mM DTT-for 30 min ved 60°C, og yderligere 0,1× SSC indeholder 10 mM DTT-for 30 min. ved 60°C. Endelig, de sektioner, der var dehydreret i ethanol (70, 95 og 100%), lufttørret, og eksponeret på BioMax XAR film (Eastman Kodak, Rochester, NY) for 9 t. For at se den celle distribution af PDE8A mRNA hybridisering, dias var belagt med Autoradiografi NTB emulsion (Eastman Kodak) og udsat for 1 uge ved 4°C., Objektglassene blev udviklet, fast, og modfarvet med hemato .ylin og monteret i Canada Balsam (Sigma-Aldrich).
PDE8A Immunpræcipitation og Assay.
Mouse sædceller blev isoleret fra cauda epididymis af en svømmetur-out-metoden (38) og homogeniseret i PBS, der indeholder 1% Nonidet (Roche Applied Science, Indianapolis, I), 1 mM EGTA, 20 mM DTT, 0,2 mM PMSF, 1 mM para-amino benzamidin, og Sigma proteasehæmmer-blanding (Sigma-Aldrich)., Den homogeniseret var centrifugeres i 5 min på 16.000 x g i en mikrocentrifuge og med 200 µl alikvoter af supernatanten, svarende til 106 sædceller, blev inkuberet natten over med 20 µl af en 1:1 blanding af protein G-agarose-perler (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) i tilstedeværelse eller fravær af PDE8A antistof (1:100, 121-AP; Fabgennix, Frisco, TX). Den næste dag, den immunoprecipitate blev vasket tre gange med PBS og derefter analyseret for PDE aktivitet i overværelse af 10 nM cAMP substrat, 40 mM, uden motor, samt Svabere (pH 7,5), 15 mM Mg-acetat, 2 mM EGTA, og 0,2 mg/ml BSA som i ref. 39.,
Immunhistotokemi.
friskfrosne musetest blev indlejret i væv-Tek O. C. T.-forbindelse og derefter skåret på en kryostat ved 20 µm pr. Vævssektioner eller isolerede Leydig-celler blev tørret og fikseret i 4% (wt/vol) paraformaldehyd/PBS (pH 7,4) ved stuetemperatur i 10 minutter og vasket tre gange med PBS. Objektglassene blev præinkuberet med blokerende buffer (5% æselserum, 1 mg/ml BSA og 0.,1% Triton X-100 i PBS) i 1 time ved stuetemperatur, inkuberet med anti-PDE8A antistof (200 µl, 1:100, C-15; Santa Cruz Bioteknologi) i PBS, der indeholder 1% æsel serum, 1 mg/ml BSA, og 0,1% Triton X-100 natten over ved 4°C, vaskes i PBS indeholdende 0,05% Tween 20 tre gange i 20 min, inkuberes med donkey anti-ged Alexa546 (200 µl, 1:500; Invitrogen) i PBS, der indeholder 1 mg/ml BSA og 0,1% Triton X-100, – for 2 timer ved stuetemperatur og vaskes., Objektglassene blev yderligere inkuberes med blokerende buffer, der indeholder 5% ged serum til 1 time ved stuetemperatur, inkuberes med cytochrom P450 side chain-spaltning enzym (CYP11A) antistof (200 µl, 1:250; Chemicon International Inc., Temecula, CA) natten over ved 4°C, vaskes i PBS indeholdende 0,05% Tween 20 tre gange i 20 min, og inkuberes med gede-anti-kanin Alexa488 (1:500; Invitrogen) som ovenfor. Afsnittene blev endelig counterstained med AT PRO-3 (1:1000; Invitrogen) i PBS for 5 min, vasket, og monteret i SlowFade Guld antiblegemiddel reagens (Invitrogen)., For at teste PDE8A antistoffets specificitet, antistof løsning var preincubated med 2,5 µg/ml-antigen-peptid (Santa Cruz Bioteknologi) i 2 timer ved stuetemperatur før farvning. Nogle sektioner blev inkuberet uden de primære antistoffer for at bestemme baggrunden på grund af de sekundære antistoffer. De immunfarvende signaler blev visualiseret med et konfokalt mikroskop (Leica SL; Leica Microsystems Inc., Bannockburn, IL). β-galactosidase-aktivitet, udtrykt med et nukleart lokaliseringssignal af Lac.-genet i målretningskassetten, blev vurderet ved St-gal-farvning., Sektionerne blev først inkuberet med anti-CYP11A antistof efterfulgt af anti-kanin alkalisk fosfatase konjugat (1:500; Invitrogen) og NBT/bcip (Roche) til farveudvikling. Then-gal-farvning blev derefter udført som beskrevet (40) i mixture-gal-blandingen ved 37.C natten over. Sektionerne blev vasket og monteret med glycerol/Tris-buffered saltvand.
Leydig celle oprensning.
Leydig celler blev isoleret som beskrevet i ref. 41. Kortvarigt blev testikler fra voksne mus dekapsuleret og dispergeret i et rystende vandbad ved 34.C i 10 minutter i 10 ml Medium 199 (m-199) med 0.,25 mg/ml collagenase D, 35 mU/ml Dispase II, og 6 µg/ml DNase I. til At opsige væv dispersion, 40 ml 1% BSA i M-199 medier, der indeholder 15 mM Hepes, 4 mM natriumbicarbonat, og 25 µg/ml soja trypsin inhibitor blev tilføjet til at udvande den oprindelige suspension. Rør blev derefter afdækket og omvendt flere gange. Seminiferøse tubuli fik lov til at bosætte sig ved tyngdekraften, og supernatanten indeholdende de interstitielle celler blev opsamlet. Proceduren blev gentaget to gange for yderligere at høste interstitielle celler., Cellerne var i pilleform i 50 ml rør ved centrifugering ved 800 × g i 20 min ved 4°C og derefter fraktioneret ved hjælp af en kontinuerlig Percoll (GE Healthcare, Piscataway, NJ) gradient (55% Percoll i HBSS bufferet med 15 mM Hepes og 25 µg/ml soja trypsin inhibitor) i et samlet volumen på 35 ml. De gradienter, der blev dannet in situ ved centrifugering i en JA-20 faste vinkel rotor (Beckman Coulter, Fullerton, CA) på 23,700 × g i 30 min ved 4°C. Et rør, der indeholder tæthed markør perler (GE Healthcare) blev anvendt som en reference til at identificere de forskellige tæthed lag., Leydig-celler blev genvundet begyndende ved en densitet på 1, 07 g / ml til bunden af gradienten. Fem mængder af HBSS blev tilføjet til at fortynde den Percoll, og cellerne var pelleteret ved 200 × g i 10 min ved 4°C. Den endelige pillen, der hidrører fra to testikler, der er beriget i Leydig celler, blev resuspenderet i 4 ml DMEM/F-12, suppleret med 1% BSA og anvendes umiddelbart til eksperimenter.
3β-Hydroystysteroid Dehydrogenase Assay.
måling af testosteronproduktion.
Leydig-celler blev resuspenderet som ovenfor, og 100-µl-alikvoter blev dispenseret i 96-brønds plader., Cellerne blev stimuleret i en 150 µl endelig mængde med de angivne koncentrationer af rekombinant VENSTRE i 3 timer i en 5% CO2-inkubator ved 37°C. Rekombinant human VENSTRE blev indhentet fra de Nationale Hormon & Peptid-Program (A. F. Parlow, Torrance, CA). Testosteron frigives i medierne af dobbelte celle prøver for hver LH koncentration blev målt ved hjælp af en immunoenzymatic assay kit fra Neogen (Lexington, KY).
alle data er udtrykt som middelværdi SD SD., EC50-værdier for VENSTRE handling på testosteron produktionen blev beregnet ved lineær montering af LH-koncentration-afhængighed kurver, der er opnået for hver Leydig celler forberedelse ved hjælp af en software-pakke (GraphPad Prism 4.0; GraphPad Software, San Diego, CA). Statistisk analyse blev udført af studerendes t-test. Forskelle blev betragtet som signifikante ved P < 0.05.