Madame Lelica

SSF koncept

tanken om at udføre den enzymatiske hydrolyse og fermentering samtidig blev fremsat af Gauss, et al. i et patent fra 1976 ., Forfatterne anførte, at glucose udbytte i en traditionel separat enzymatisk hydrolyse (ved hjælp af enzymer, der produceres af svampen Trichoderma reesei) var lav, sandsynligvis på grund af slutproduktet hæmning af hydrolyse af glukose og cellobiose. Forfatterne kunne imidlertid vise, at de opnåede et højere samlet ethanoludbytte ved anvendelse af SSF, hvilket de tilskrev fjernelse af glucose og cellobiose ved fermenteringen og den deraf følgende frigivelse af slutproduktinhibering., Udtrykket SSF (forkortelsen SSF bruges ofte også til faststoffermentering) blev ikke brugt af forfatterne på det tidspunkt, men blev den almindelige notation for denne proces inden for få år fra den oprindelige opfindelse. Undgåelse af slutproduktinhibering er stadig sandsynligvis den vigtigste grund til at bruge SSF, men der er flere yderligere potentielle fordele. Gauss og kolleger nævnte for eksempel fordelen ved, at glukose ikke behøver at blive adskilt fra ligninfraktionen efter et separat en .ymatisk hydrolysetrin, hvorved man undgår et potentielt tab af sukker., Desuden reducerer kombinationen af hydrolyse og fermentering antallet af nødvendige fartøjer og dermed investeringsomkostninger. Faldet i kapitalinvesteringer er blevet anslået til at være større end 20%. Dette er meget vigtigt, da kapitalomkostningerne kan forventes at være sammenlignelige med råvareomkostningerne ved ethanolproduktion fra lignocellulose . Andre fordele, der vedrører samforbrug af pentose-og He .osesukker, og afgiftning er blevet tydelige for nylig, som det vil blive diskuteret senere i denne gennemgang.,

uundgåeligt er der også ulemper ved SSF i sammenligning med den separate hydrolyse og fermentering (SHF) proces. Den optimale temperatur for en .ymatisk hydrolyse er typisk højere end fermenteringen – i det mindste ved anvendelse af gær som fermenteringsorganisme. I en SHF-proces kan temperaturen for den en .ymatiske hydrolyse optimeres uafhængigt af fermenteringstemperaturen, hvorimod der skal findes et kompromis i en SSF-proces. Desuden kan gæren ikke genbruges i en SSF-proces på grund af problemerne med at adskille gæren fra lignin efter fermentering., Derfor vil gæren nødvendigvis repræsentere et udbyttetab i en SSF-proces, hvis gæren er fremstillet af kulhydrater i processen (se figur 1) eller en driftsomkostning, hvis den leveres eksternt. En .ymerne er lige så vanskelige at genbruge, også i en SHF-proces. En .ymerne produceres enten i processen (se figur 1) – hvilket repræsenterer et tab af substrat – eller tilføres eksternt og øger dermed de kemiske omkostninger., Recirkulation af en .ymer er lige så vanskelig, da en .ymerne binder til substratet, skønt en delvis desorption kan opnås efter tilsætning af overfladeaktive stoffer .

tilgængeligheden af lignocelluloseholdige råvarer, varierer, afhængigt af geografisk placering (se fx, Kim og Dale), og de lignocellulosiske råmaterialer er ret heterogene med hensyn til både struktur og kemisk sammensætning (Se tabel 1). Denne heterogenitet har en stærk indflydelse på den proces design, der påvirker stort set alle procestrin, dvs den mekaniske håndtering af materialet, forbehandling betingelser, valg af enzymer og gær stammer, samt adskillelse og egenskaber af de resterende lignin. Dette vil fremgå af diskussionen nedenfor.,

Forbehandling

formålet med forbehandling er med til at ændre den celluloseholdige struktur og øge hastigheden af enzymatisk hydrolyse af primært cellulose. Dette skal ske med en minimal dannelse af forbindelser, som hæmmer de fermenterende mikroorganismer . Det tilgængelige overfladeareal betragtes som en af de vigtigste faktorer, der påvirker effektiviteten af en .ymatisk cellulosenedbrydning ., I indfødt træ er kun en lille brøkdel af cellevægskapillærerne tilgængelige for en .ymerne . Forbehandling, men øger den tilgængelige område på flere måder ; i), fragmenter og revner dannes giver øget område , ii) hemicellulose brøkdel er hydrolyseret, som mindsker afskærmning effekter , iii) lignin også undergår strukturelle ændringer og træet er delignified til forskellige grader, afhængigt af den forbehandling teknologi . Således kan afskærmningen af mikrofibriller og okkludering af porer forårsaget af lignin fjernes., Andre faktorer, menes at påvirke fordøjelighed i SSF, er substratet krystallinitet og graden af polymerisation (DP) .

forbehandlingsmetoderne kan opdeles i fysiske og kemiske metoder, og kombinationer af disse to bruges ofte (se f.eks. ). Typen af råmateriale påvirker stærkt valget af forbehandlingsmetode. Hemicellulosen er for eksempel acetyleret i høj grad i materialsylan-rige materialer., Da acetat frigøres under hydrolyse, er forbehandlingen af disse materialer til en vis grad autokatalytisk og kræver mindre tilsatte syre-og mildere procesbetingelser. Imidlertid tilføjer det frigjorte acetat toksiciteten af hemicellulosehydrolysaterne.

ammoniakfiber / fryseeksplosion (AFE.) forbehandling betragtes som en attraktiv metode til forbehandling af landbrugsrester, hvilket giver meget fordøjelig cellulose. AFE .depolymeriserer lignin, fjerner hemicellulose og dekrystalliserer cellulose., Den moderate temperatur og pH minimerer også dannelsen af sukker nedbrydningsprodukter. Metoden lider imidlertid af høje omkostninger ved ammoniak og ammoniakgendannelse . I denne sammenhæng skal kalkmetoden, der er baseret på calcium (eller natrium) hydro .id, også nævnes. Alkali forbehandlinger køres ved lavere temperaturer i lange opholdstider, og med hensyn til AFE. – metoden opnås en delignificering af biomassen.

Dampeksplosion er en intensivt undersøgt forbehandlingsmetode ., Virkningerne af ukatalyseret dampeksplosion – og flydende varmtvandsforbehandling – på biomassen tilskrives primært fjernelse af hemicelluloser. Ved tilsætning af en syrekatalysator kan hydrolysen forbedres yderligere . Fortyndede syreforbehandlinger ved hjælp af H2SO4 eller SO2 er de mest undersøgte forbehandlingsmetoder på grund af deres effektivitet og prisbillighed. Disse metoder er blevet anvendt i pilotanlæg og er derfor tæt på kommercialisering . Syre katalyseret behandling forbedrer hemicellulose fjernelse , giver en delvis hydrolyse af cellulose og ændrer lignin struktur ., De største ulemper er relateret til krav til procesudstyr og inhibitordannelse . Indtil videre har vellykkede forbehandlinger med alkali, AFE .og flydende varmt vand været begrænset til landbrugsrester og urteagtige afgrøder , mens syrekatalyserede dampforbehandlinger har genereret høje sukkerudbytter fra disse materialer såvel som fra nåletræfoder.

en simpel kvantificering af hårdheden af en dampforbehandlingsproces er den såkaldte Sværhedsfaktor, log(R0)., This factor combines the time and the temperature of a process into a single entity, R 0 = t ⋅ e T r − 100 14.75 MathType@MTEF@5@5@+=feaafiart1ev1aaatCvAUfKttLearuWrP9MDH5MBPbIqV92AaeXatLxBI9gBaebbnrfifHhDYfgasaacPC6xNi=xH8viVGI8Gi=hEeeu0xXdbba9frFj0xb9qqpG0dXdb9aspeI8k8fiI+fsY=rqGqVepae9pg0db9vqaiVgFr0xfr=xfr=xc9adbaqaaeGaciGaaiaabeqaaeqabiWaaaGcbaGaemOuai1aaSbaaSqaaiabicdaWaqabaGccqGH9aqpcqWG0baDcqGHflY1cqWGLbqzdaahaaWcbeqcfayaamaalaaabaGaemivaq1aaSbaaeaacqWGYbGCaeqaaiabgkHiTiabigdaXiabicdaWiabicdaWaqaaiabigdaXiabisda0iabc6caUiabiEda3iabiwda1aaaaaaaaa@403B@ ., For syrekatalyserede forbehandlinger anvendes den kombinerede Sværhedsfaktor, log (CS), engang. Dette tager også højde for pH, log(CS) = log (R0) – pH, og typiske værdier for syrekatalyseret dampeksplosion forbehandling af nåletræ ligger i området 2 til 4 .

optimale forbehandlingsbetingelser i en SSF-proces adskiller sig ikke nødvendigvis meget fra dem i en SHF-processer, der anvender lignocellulosisk biomasse. Imidlertid omdannes adskillige forbindelser, der er til stede i forbehandlingshydrolysater, som hæmmer en .ymatisk hydrolyse af de fermenterende organismer., Dette er en sandsynlig forklaring bag de højere rapporterede ethanoludbytter i SSF sammenlignet med SHF . Inhibitordannelse fra forbehandlingen kan derfor tolereres i højere grad i en SSF-proces. Inhiberende forbindelser kan sættes i tre hovedgrupper; furaldehyder, svage syrer og phenoler. De to mest almindelige furaldehydes, HMF (5-hydroxymethyl-2-furaldehyd) og furfural (2-furaldehyd), der er dannet ved svære betingelser fra hexoses og pentoses, hhv ., Svage syrer fra lignocellulosiske materialer, såsom eddikesyre, myresyre og levulinsyre, dannes hovedsageligt ved de-acetylering af hemicellulose eller HMF-nedbrydning . Phenolforbindelser dannes hovedsageligt under lignin nedbrydning, og findes i mange varianter, afhængigt af typen af lignin . For en mere dybdegående diskussion om hæmning se f .gennemgangen af Almeida et al.

en .ymatisk hydrolyse

en vellykket forbehandling har i vid udstrækning fjernet hemicellulosen, hvilket efterlader cellulosen tilgængelig til hydrolyse., Da de mest almindeligt anvendte mikroorganismer til ethanolproduktion udelukkende udnytter sukkermonomerer, skal cellulosen hydrolyseres, hvilket i en SSF forekommer samtidig med fermenteringen. Historisk set er industriel cellulosefordøjelse foretaget med sur hydrolyse, og optimering af sur hydrolyse af forskellige lignocellulosiske materialer er blevet udført til ethanolproducerende formål ., Sur hydrolyse producerer imidlertid hydrolysater, der er relativt giftige for de fermenterende mikroorganismer, og det maksimale glukoseudbytte er begrænset til cirka 60% i en batchproces af kinetiske årsager . En .ymatisk nedbrydning af cellulosefraktionen har på den anden side potentialet til at give relativt ikke-toksiske hydrolysater med højere sukkerudbytter.

en Enymer specialiseret i nedbrydning af β-1-4-glycosidbindinger af glucan kaldes kollektivt cellulaser. I 1950 præsenterede Reese et al en model af en .ymatisk cellulosehydrolyse baseret på Flere en .ymer (C1 og C.)., C1-en .ymet antages at producere kortere polyanhydro-glucosekæder, mens opløsningen blev tilskrevet C. – en .ymet. Grundlæggende gælder det samme billede i dag, men der har været en enorm fremgang i viden om alle de forskellige specifikke en .ymkomponenter involveret. Cellulaserne er opdelt i tre underkategorier, der repræsenterer tre typer aktiviteter: endoglucanaser, e .oglucanaser (cellobiohydrolaser) og β-glucosidaser., Endoglucanaser reducerer signifikant polymerisationsgraden af substratet ved tilfældigt at angribe de indre dele, hovedsageligt i de amorfe områder af cellulose. E .oglucanaser (eller cellobiohydrolaser) forkorter på den anden side trinvist glucanmolekylerne ved at binde til glucanenderne og frigive hovedsageligt cellobioseenheder. Endelig opdeler dis-glucosidaser disaccharidcellobiosen i to enheder glucose.,

flere typer mikroorganismer kan producere cellulasesystemer, herunder aerob filamentøse svampe, aerobe actinomyceter, anaerobe hyperthermofile bakterier og anaerobe svampe (se f.eks. ). Intensiv forskning på de aerobe trådformede svampe T. reesei i løbet af de sidste årtier har resulteret i en effektiv cellulaseproducerende organisme, som i øjeblikket dominerer den industrielle cellulaseproduktion .

som allerede nævnt er en vigtig fordel med SSF sammenlignet med SHF reduktionen af slutproduktinhibering med sukkerarter dannet ved hydrolysen., Fermenteringsproduktet ethanol hæmmer også hydrolyse, men i mindre grad end cellobiose eller glucose . En anden fordel er, at hæmmere fra forbehandlingen kan metaboliseres af mikroorganismerne . Imidlertid kan også SSF-processen lide af ufuldstændig hydrolyse af den faste lignocellulosiske fraktion. Bortset fra hæmning af slutprodukter eller andre komponenter kan dette skyldes en .ymdeaktivering , uproduktiv en .ymadsorption, faldende tilgængelighed af kædeender og stigende krystallinitet med omdannelse af forbehandlet cellulose .,

i en industriel SSF bør en .ym-og cellekoncentrationer være passende afbalanceret for at minimere omkostningerne til gær-og en .ymproduktion. Synergier mellem de enzymer, fx endo-exo synergisme , exo-exo synergisme , og synergien mellem endo – eller exoglucanases og β-glucosidases , bør også optimeres ved tuning sammensætningen af enzym-blandinger. Den optimale sammensætning vil helt sikkert afhænge af det lignocellulosiske råmateriale.,

fermenterende mikroorganismer

de generelle krav til en organisme, der skal anvendes i ethanolproduktion, er, at den skal give et højt ethanoludbytte, en høj produktivitet og være i stand til at modstå høje ethanolkoncentrationer for at holde destillationsomkostningerne lave . Ud over disse Generelle krav er inhibitortolerance, temperaturtolerance og evnen til at udnytte flere sukkerarter afgørende for SSF-applikationer. Tolerance over for lave pH-værdier vil minimere risikoen for forurening., Arbejdshesten i stivelse-eller saccharosebaseret ethanolproduktion er almindelig bagergær, Saccharomyces cerevisiae. Denne organisme producerer ethanol ved et højt udbytte (højere end 0,45 g g-1 ved optimale betingelser) og en høj specifik hastighed (op til 1,3 g-1 cellemasse h-1 ). Det har også en meget høj ethanoltolerance, over 100 g L-1 er rapporteret for nogle stammer og medier . Derudover har organismen vist sig at være robust over for andre hæmmere, og den er derfor egnet til fermentering af lignocellulosiske materialer .,

Hemicellulose fra hårdttræ og landbrugsrester er typisk rige på xylaner (jf. Tabel 1 – – hårdttræ, der primært indeholder O-acetyl-4-O-methylglucuronoylanylan, mens Græsser indeholder arabino .ylan . Nåletræ hemicellulose, på den anden side, indeholder flere mannaner – primært i form af galactoglucomannan – og mindre .ylan. Mannose gæring er normalt effektiv i S., cerevisiae, hvorimod evnen til at fermentere galactose er belastningsafhængig , og generne til galactoseudnyttelse undertrykkes endvidere af glucose , hvilket fører til en typisk sekventiel udnyttelse af sukkerne. Det er klart, at fermentationylosegæring er et mere vigtigt spørgsmål for landbrugsrester og hårdttræ end for blødt træ. Apartylose metaboliseres ikke af vildtype S. cerevisiae bortset fra en mindre reduktion tilylylitol. Dette, og for nogle dele temperaturtolerancen, har været hovedårsagen til interessen for også at teste andre mikroorganismer for lignocellulosekonvertering i SSF.,

naturligt ferylose-fermenterende gær, såsom Pichia stipitis og Candida shehatae , kan potentielt være fordelagtigt at anvende i SSF af materialer med højt contentsylanindhold. Imidlertid er deres tolerance over for inhiberende forbindelser i ikke-o lignificerede lignocellulosehydrolysater ret lav , og derudover kræves en meget lav og velkontrolleret tilførsel af ilt til effektiv fermentationylosefermentering . De vigtigste “konkurrenter” til gæren har været bakterierne bacteriaymomonas mobilis og genetisk manipuleret Escherichia coli. `.. , mobilis, en obligatorisk anaerob bakterie, der mangler et funktionelt system til O .idativ phosphorylering, producerer ethanol og kuldio .id som vigtigste fermenteringsprodukter. Interessant nok bruger mobil. mobilis Entner-duodoroff-vejen, som giver en lavere ATP-produktion pr. Dette giver igen et lavere biomasseudbytte og et højere ethanoludbytte på glucose sammenlignet med S. cerevisiae . Wildild-type mobil. mobilis mangler imidlertid evnen til at fermentere pentosesukker, og en stor ulempe er endvidere, at det ikke er en meget robust organisme., Generelt synes bakterier at være mindre tolerante over for lignocellulose-afledte hæmmere , og et afgiftningstrin kan være nødvendigt inden fermenteringen. I modsætning til bagegær og Z. mobilis, E. coli, der er i stand til metabolisering af en bred vifte af substrater (herunder hexoses, pentoses og laktose), men wild-type organisme har en blandet fermentative vej, og er således en dårlig ethanol producent. I et skelsættende bidrag, tildelt U. S. patent nummer 5000000, en stamme af E., coli, der var genetisk manipuleret til en ethanol producent af overexpression af PDC (kodning pyruvat decarboxylase) og adhB (kodning alkohol dehydrogenase) fra Z. mobilis . Gode resultater er opnået med rekombinant E. coli, fx KO11 stamme, som har vist ethanol udbyttet fra 86 til tæt på 100% af det teoretiske, og endelig ethanol koncentrationer på op til 40 g L-1 på hemicellulose hydrolyzates af bagasse, majs stover og majs skrog ., Imidlertid blev kun den flydende fraktion anvendt i rapporterede studier, og hydrolysaterne blev endvidere afgiftet før anvendelse ved overlimning til pH 9 med calciumhydro .id og derefter justeret til pH 6,0–6,5 med HCl. Da den optimale pH er 6,5, er E. coli desuden mindre egnet til SSF-processer med T. reesei-cellulaser, som generelt anses for at have et pH-optimal omkring 4,8 .

Pentosefermentering ved konstrueret S. cerevisiae

På grund af de meget attraktive egenskaber ved S., cerevisiae i industrielle fermenteringer har der været betydelig indsats i de sidste årtier for at designe rekombinante ferylose-og arabinosefermenteringsstammer af denne gær. Xylose gæring stammer af S. cerevisiae kan i princippet være fremstillet enten ved at indføre gener, der koder for xylose isomerase (XI) fra bakterier og svampe , eller gener, der koder for xylose-reduktase (XR) og xylitol dehydrogenase (XDH) fra svampe . Også det endogene geneks1-gen, der koder for .ylulokinase (.k), skal overudtrykkes for at opnå signifikant fermentationylosefermentering ., Transportproteiner er nødvendige for optagelse af xylose såvel som af andre sukkerarter i gær. I S. cerevisiae har det vist sig, at heylose transporteres af HE .osetransportørerne , men affiniteten for 200ylose er cirka 200 gange lavere end for glukose . Følgelig hæmmes uptakeyloseoptagelsen konkurrencedygtigt af glucose.

Der er 20 forskellige gener, der koder for sukker transport relaterede proteiner, 18 individuelle systemer (Hxt1-17 og Gal2) og to relateret signal proteiner (Snf3p og Rgt2p)., Transportørerne udviser forskellige affiniteter for sukkerarter, og ekspressionen af deres tilsvarende gener reguleres af sukkerkoncentrationerne, dvs .tilgængeligheden af carbonkilden. Det er tidligere blevet antydet, at glucoseylose optages af både høj – og lavaffinitetssystemer hos glukosetransportører (figur 2), men optagelsen øges ved tilstedeværelse af lave glukosekoncentrationer . Undersøgelser har vist, at høj – og mellem-affinitet hexose transportører; Hxt4, Hxt5 Hxt7 og Gal2 er faktisk den vigtigste transporter for xylose ., Endvidere har det vist sig, at der er behov for en lav (men ikke-nul) glukosekoncentration i mediet for effektiv uptakeyloseoptagelse . Dette er blevet forklaret ved et behov for glucose til ekspression af glycolytiske en .ymer og mellemprodukter samt dannelse af mellemmetabolitter til de første trin i metabolismylosemetabolismen og pentosephosphatvejen . En anden mulig forklaring, der udledes af både eksperimenter og computermodellering, er, at glukosen er nødvendig til ekspression af HE .osetransportører med gunstige transportylosetransportegenskaber, f .eks. h .t4., For at opnå effektiv co-fermentering af glucoseylose og glucose i SSF (undertiden betegnet SSCF – samtidig saccharificering og co-fermentering) med rekombinant S. cerevisiae er det derfor nødvendigt at holde glukosekoncentrationen lav, hvilket er vist i praksis i nyere SSF-undersøgelser .