Madame Lelica

Struktura ACLY s CoA odhaluje produktivní a neproduktivní CoA konformace

vyrobeno rekombinantní, full-délka ACLY v Escherichia coli pro všechny naše biochemické a strukturální analýzy (Extended Data Obr. 1a, b)., Diferenciální skenovací fluorimetrie enzymu s různými kofaktory potvrdila vazbu a potenciální strukturální změny spojené s ligandy přidanými samostatně nebo v kombinaci (rozšířená data Obr. 1c). Tyto údaje jsme použili k určení struktury ACLY s jeho ko-substráty nebo ko-produkty.

připravili Jsme rekombinantní protein a zpočátku provádí negativní skvrna single-particle analysis of protein v nepřítomnosti všech metabolitů (ACLY-apo)., Dvourozměrná (2D) třída v průměru od 3000 částic potvrdila, že protein tvořil tetramer (rozšířená Data Obr. 2a, b). Abychom získali více strukturálních detailů, provedli jsme studii kryo-EM na komplexu ACLY–citrát-CoA. Po několika kolech optimalizace kryo-EM vzorků, jsme zjistili, D2, symetrické kryo-EM struktura ACLY–citrát-CoA struktura průměrné celkové rozlišení 3.0 Å. (Rozšířené Údaje Obr. 2c, d, 3 a 4 a tabulka 1).,

ACLY–citrát-CoA strukturu tvoří homotetramer s centrální tetrameric CSH modul a dva ASH domén na opačných koncích CSH modul (protomers 1 & 2 a 3 & 4) (Obr. 1a, b). Doména popela (rezidua 1-806) přijímá strukturu velmi podobnou dříve hlášené architektuře α/β izolované N-terminální domény vázané na citrát a ADP24., CHS doména (zbytky 859-1101) se skládá výhradně z stabilizovaných a krátké smyčky, s strukturální homologie se dimer citrát syntázy dimery, že kříž, na ~90° úhly (Extended Data Obr. 5a). Ash a csh domény každého polypeptidového řetězce jsou spojeny do značné míry rozšířenou oblastí cívky ~ 50-reziduí s výjimkou krátké α-šroubovice mezi zbytky 824 a 829. Spirální oblast v tomto linkeru je jediným bodem významného kontaktu (interakcí van der Waals) mezi dvěma doménami popela na jedné straně molekuly., Rozšířený linker umožňuje CSH jedné podjednotky komunikovat s ASH doménou jiné podjednotky na opačné straně modulu CSH. V kontrastu k relativně řídké interakce mezi ASH protomers, CSH domén tvoří rozsáhlou síť převážně van der Waalsovy interakce, které by naznačovaly, že CSH domény fungovat jako tuhé tetrameric modul, zatímco čtyři ASH domény jsou více flexibilní. To je v souladu s pozorovaným odhadem lokálního rozlišení EM na mapě EM, který je nejvyšší v doméně CSH(2.8 Å, rozšířená data Obr., 4c) a naše předchozí pozorování, že doména CSH má vyšší teplotu tání vzhledem k popelu ~75 °C oproti ~55 °C, respectively21.

CoA se váže na rozhraní mezi csh a Ash doménami samostatných podjednotek a zdá se, že „sešívá“ superdomény dohromady. Adenin základnu a ribóza prsten komunikovat s CSH domény jednoho monomeru a pantotenovou ruku a β-merkapto skupiny lepení do aktivního místa ASH doménu z jiné podjednotky (Obr. 1C (vlevo) a obr. 1d (vlevo))., Modelování CoA je založeno na pozorování, že fosforylovaná skupina ADP je dobře vyřešena v hustotě kryo-EM. Skupina mercapto však nebyla dobře vyřešena, což naznačuje flexibilitu tohoto regionu. I když několik zbytků z CSH a POPEL domén, aby van der Waalsovy interakce s CoA, vodíkové vazby z S574, R576 a S577 z POPELA domény a K964 od CSH domény k ribóza, fosfát kyslíky se zdají hrát důležitou roli zejména při sešívání CoA na POPEL–CSH rozhraní., Zajímavé je, E599 je ve vodíku-lepení vzdálenost k modelované atom síry CoA, ukazujících, že by to mohlo hrát důležitou roli katalyzátoru. Význam bílkovin–CoA interakce z POPELA a CSH domény je podporován mutační citlivost zbytky R576 a K964, a potenciální roli katalyzátoru z E599 je podporována jeho mutační citlivost k nebo Q, ale ne na D (Obr. 1f). Přestože byl citrát zařazen do vzorku pro rekonstrukci kryo-EM, nemohl být s jistotou vyřešen v mapě kryo-EM.,

Vzhledem k nevyřešené hustota pro merkapto skupinu CoA, provedli jsme další rekonstrukce ACLY–citrát-CoA struktury bez uložení D2 symetrie určit, zda CoA může přijmout různé konformace v různých protomers. Podařilo se nám připravit rekonstrukci bez uložení symetrie (C1, asymetrické uzavřené) do nominálního rozlišení 3,5 Å. V tomto ACLY–citrát-CoA-C1 asymetrické uzavřené struktury, řešení kolem ASH doména je chudší než v D2 konstrukce, ale místní rozlišení kolem CSH domény zůstává relativně vysoká, z 2,8 na 3,2 Å., Analýza této asymetrické uzavřené struktury ACLY-citrát-CoA-C1 odhalila, že každá z domén popela a tři ze čtyř domén CSH a molekul CoA přijaly stejnou konfiguraci jako struktura D2. Nicméně, jeden z CoA molekuly přijímá alternativní konformaci, ve které fosforylována ADP část je posunuta ~8 Å k CSH modul a pantotenovou paže je ohnutá komunikovat s CSH (Obr. 1b, C (vpravo)a obr. 1e). Hustota kryo-EM odpovídající této alternativní konformaci CoA je velmi jasná (obr. 1c (vpravo))., Pozoruhodné je, cryo-EM hustota je také pozorován pro dobře uspořádané molekuly vody, které se objeví na most vodíková vazba interakce mezi svorkou atom síry CoA s postranní řetězce zbytků H900, D1026 a R1065 s dalšími van der Waalsovy interakce z L969, I973, H975 a R976 (Obr. 1d (vpravo)). Současně s touto alternativní CoA konformaci, smyčky ve CSH doména (zbytky 965-986) a boční spirál posun ubytovat se střídají polohy CoA adenin, báze (Obr. 1e)., Mutace H975, R976, D1026 a R1065 alanin všechny show ohrožena aktivity, což naznačuje, že vazba CoA do CSH doména je nějak zapojen do aktivity enzymu (Obr. 1f). Vzhledem k tomu, že CoA musí reagovat s citrátem v POPEL domény, odkazujeme na CoA konformací s merkaptamin z pantotenovou ruku, která ukazuje směrem k ASH a CSH „jako“ produktivní “ a „neproduktivní‘ CoA konformací, respektive povinen ACLY.,

Struktura ACLY–citrát-CoA subpopulace odhaluje asymetrické ASH směry

kromě hlavní ACLY–citrát-CoA částic obyvatel, což představuje 57% třídy 3 částice, subpopulace ACLY–citrát-CoA komplexní částice, což představuje 23% z podtřídy částic (10% celkově) byl také zachycen v 3D rekonstrukce bez uložení symetrie rozlišení 4.3 Å (Extended Data Obr. 3)., Tato subpopulace částice má celkovou strukturu, která je podobná velké ACLY–citrát-CoA populace s výjimkou, že jeden ze čtyř ASH domén se otáčí ~50° směrem k jeho nejbližší ASH podjednotky přijmout více „otevřená“ konformace, takže jsme se odkazují na to jako ‚ACLY–citrát-CoA-C1 asymm otevřít‘. V této struktuře je hustota viditelná pouze pro fosforylovanou ADP skupinu dvou molekul CoA vázaných na dvě symetrické domény popela(obr. 2a, b). Jedna ze symetrických a asymetrických podjednotek popela nevykazuje žádné důkazy o vazbě CoA., Zejména se zdá, že asymetrická ASH doména je neslučitelná s produktivní vazbou CoA (obr. 2c). Navrhujeme, aby tento ACLY–citrát-CoA-C1 asymm otevřená struktura představuje přechodný stav ACLY, kde dvě aktivní místa jsou připraveny pro katalýzu a dvě nejsou. Pozorování této struktury také naznačuje, že čtyři aktivní místa mohou fungovat nezávisle.

Struktura ACLY-apo stav je nepříznivý pro CoA binding

Vzhledem k omezené interakce mezi CSH a POPEL domén, jsme se zeptali struktura ACLY v nepřítomnosti vázány ligandy. Za tímto účelem jsme určili strukturu kryo-EM ACLY ve formě apo,kterou jsme dokázali vyřešit na rozlišení 4.3-Å (rozšířená Data Obr. 4a a tabulka 1)., Srovnání ACLY-apo a ACLY–citrát-CoA struktury vyplývá, že v apo stát, každý z POPELA dvojice na opačných koncích tetramer jsou otočeny směrem k sobě do ~10° tvoří více otevřít ACLY tetramer a místo POPELA domén na pozice, které se objevují na nemilosti produktivní CoA vazby (Obr. 3). Konkrétně, POPEL smyčky se soustředil na F533, S574 a K1018 (z přilehlých CSH domény) by střet s CoA jako vázány v ACLY–citrát-CoA strukturu (Obr. 3b)., Kromě toho, dva zbytky, které jsou v rámci vodík-vazebné vzdálenosti CoA z POPELA domény, R576 a E599, pohyb vodíku-lepení vzdálenost v ACLY-apo strukturu (Obr. 3c). Mezitím zůstává modul CSH mezi oběma strukturami do značné míry nezměněn. Srovnání struktur ACLY-apo a acly–citrát-CoA společně ukazuje, že struktura ACLY-apo musí být uspořádána tak, aby vyhovovala substrátu CoA.

ACLY–acetyl-CoA–OAA komplexu odhaluje CoA–citrát lyázou reakce se vyskytuje v POPEL domény

Diferenční skenovací fluorimetrie údajů vyplynulo, že oba acetyl-CoA a OXALACETÁT produkty stabilizoval ACLY bílkovin (Extended Data Obr. 1c)., Toto zjištění vyplynulo, že bychom mohli zachytit ACLY–OAA–acetyl-CoA produktu složitá, a tak lépe pochopit mechanismus reakce. Za tímto účelem jsme určili strukturu kryo-EM komplexu, kterou jsme vyřešili na rozlišení 3.1-Å pomocí symetrie D2(rozšířená Data obr. 4). Celková struktura ACLY–co-produkt komplex byl nejvíce podobný symetrické ACLY–co-substrát (ACLY–citrát-CoA-D2) komplexní, s celkovou root-mean-square deviation (r.m.s.d.) z 0.407 Å pro Ca atomů (Obr. 4a)., Zjistili jsme, že acetyl-CoA obsadil na stejné vazebné místo jako CoA a byl také stabilizován stejné základní zbytků, R576 a K964 (Obr. 4b). Kromě toho jsme byli schopni jednoznačně modelovat dvě molekuly OAA vázané na každou podjednotku ACLY(obr. 4b, c). Jedna molekula OAA (OAA1) se překrývá s citrátovou vazebnou kapsou v oblasti popela a proximálně s acetylovou skupinou acetyl-CoA. OAA1 provádí relativně skromné interakce s proteinem, včetně vodíkových vazeb na interakce n346 a T348 a van der Waals s f547., Druhá molekula OAA (OAA2) je vázána na doménu CSH a provádí rozsáhlejší interakce s ACLY než OAA1. OAA2 kontakty CSH modulu prostřednictvím vodíkových vazeb na H900, D1026, R1065 a R1085 a přes van der Waalsovy interakce F935 a F1061 z jedné podjednotky, jakož i prostřednictvím vodíkové vazby k R1065 z jiné podjednotky (Obr. 4c). OAA2 se dobře překrývá s vázanou OAA v prasečím srdci citrát synthase25 (rozšířená Data Obr. 5b).

také Jsme rafinovaný kryo-EM mapa ACLY–OAA–acetyl-CoA struktura bez omezení symetrie a získat shodné struktury s D2 symetrií, s výjimkou, že jeden ze čtyř acetyl-CoA molekuly ukázaly dvě možné konformace pantotenovou ruku z acetyl-CoA, jeden s merkaptamin CoA na POPEL domény, jako v ostatních třech protomers, a druhý směrem k CSH domény (Extended Data Obr. 6a)., Na rozdíl od alternativní konformace CoA nalezené ve struktuře ACLY–citrát-CoA se však Poloha fosforylované skupiny ADP v těchto dvou konformacích nezměnila. Potenciální alternativní konformace acetyl-CoA by mohla naznačovat možnou cestu uvolňování substrátu v obratu enzymu nebo autoinhibitárním stavu enzymu (diskutováno níže).

pozorování OAA1 a acetyl-CoA výrobky v POPEL domény silně navrhl, že lyasy chemie se provádí tam, na rozdíl od předchozích návrhů, které tato chemie se provádí v CSH domain22,23., Domníváme se, že OAA2 může funkce pomoci organizovat CSH domény pro spolupráci s ASH domény a/nebo působit jako druhý OAA produktu autoinhibitory stránky, které by mohly vázat na pantotenovou ruku z acetyl-CoA (nebo merkaptamin CoA) sedět přes CSH domény, tak, že vzájemně se vylučující vazba CoA v produktivní konformace je inhibována při vysoké buněčné OAA koncentrace (Extended Data Obr. 6a)., Zajímavé je, že zatímco produktivní rozšířené CoA orientace s merkaptamin směřující na POPEL domény nemůže být modelovány do ACLY-apo bez významné stérické střetu (Obr. 2B), převrácená orientace s cysteaminem směřujícím k doméně CSH může (rozšířená Data Obr. 6b). To je v souladu s naším zjištěním, že CoA je schopen se vázat na ACLY v nepřítomnosti citrát a/nebo ATP (údaje nejsou uvedeny), ale navrhujeme ohnuté konformaci, jak bylo pozorováno v jedné z ACLY–citrát-CoA-C1 protomers (Obr. 1c (vpravo)a obr., 1d (vpravo)) a také izolovaná struktura csh domain22.

v souladu s hypotézou, že OAA2 může sloužit jako ACLY autoinhibitory stránky, předchozí studie ukázaly, že OAA je schopen inhibovat krysa játra ACLY způsobem, který je non-konkurenční s citrate26. K ověření funkčního významu dvou míst OAA pozorovaných ve struktuře ACLY-OAA-acetyl-CoA jsme použili experiment kalení fluorescence v ustáleném stavu., Jako kontrolní experiment, jsme se nejprve titruje citrátu do ACLY v nepřítomnosti nebo přítomnosti saturující koncentrace CoA a byli schopni, aby se vešly data do jednoho citrát vazebné místo s Kd hodnoty 3,4 ± 0,5 µM a 1,4 ± 0.3 µM v nepřítomnosti nebo přítomnosti CoA, s dobrou R2 hodnoty 0,92 a 0,84, respektive (Obr. 4d). To je v souladu s jedním citrát vazebné místo pozorován v ACLY ASH domény krystalové struktury povinen citrate13 a krystalové struktury neporušené ACLY vázané na CoA a citrate22, což ukazuje, že CoA stabilizuje citrát závazné v ACLY ASH domain22., Dále jsme titruje OAA do ACLY, a zjistil, že data se vešly výrazně lepší dvě stránky modelu (R2 = 0.99), než na jednom místě model (R2 = 0.93) (Obr. 4e). Dvě stránky závazný model lépe ubytováni bifázický pokles fluorescence, že se stává zřejmé, při vyšších OAA koncentrace a dává vzniknout vysokou afinitou OAA vazebné místo (Kd = 15 ± 4 µM), který tvoří jednu třetinu z celkové fluorescence změnit a nízkou afinitou OAA vazebné místo (Kd = 1,300 ± 500 µM), která tvoří zbývající dvě třetiny z celkové fluorescence změnit (Obr. 4e)., Tyto údaje jsou v souladu s funkčním významem dvou vazebných míst OAA pozorovaných ve struktuře ACLY-OAA-acetyl-CoA.

ACLY-E599 je v pozici, aby fungovaly jako důležitý katalytické zbytky

ACLY–co-o produktu struktura nám umožnila řešit dlouhotrvající otázka o ACLY molekulární mechanismus. ACLY se navrhuje štěpit citryl-CoA, meziprodukt za pomoci obecné základní extrahovat proton z citrátu substrátu a/nebo obecné kyseliny reprotonate na OAA odchodu group16,27,28., To je v souladu s analýzou profilu rychlosti pH ACLY s pKa ~8.5 (obr. 5a). Předpokládáme, že evolučně zachovaných E599 je umístěn tak, aby hrát důležitou roli katalyzátoru, jako obecné základní a/nebo kyseliny, a/nebo pro stabilizaci fosfo-citryl-CoA meziprodukty (viz další bod a Obr. 4b). Relativně vysoká pKa pro pohřbený zbytek glutamátu byla zaznamenána již dříve. V souladu s důležitou katalytickou rolí pro E599 jsme zjistili, že mutanty E599A a E599Q významně narušily aktivitu (obr. 1F), i když vazba kofaktoru nebyla ovlivněna (obr. 5b)., Naproti tomu jsme zjistili, že podobně kyselý mutant E599D vykazoval podobnou aktivitu jako WT ACLY (obr. 1F), s podobným profilem rychlosti pH (obr. 5a). Společně údaje argumentují významem E599 pro katalýzu ACLY.

ACLY katalýza probíhá pomocí fosfo-citryl-CoA, meziprodukt v POPEL domény

identifikace E599 jako důležitý katalytických reziduí pro štěpení citryl-CoA adduct na acetyl-CoA a OXALACETÁT produkty nám poskytl příležitost k pasti na reakční meziprodukty z ACLY-E599Q mutant v přítomnosti ATP, citrát a CoA ko-substráty., Proto jsme smíšené ACLY-E599Q mutant s saturující koncentrace ATP, citrát a CoA (ACLY-E599Q–ATP-citrát-CoA) a určí jeho kryo-EM struktury, které jsme byli schopni vyřešit k celkovému řešení 2.85 Å. Struktura byla určena uložení D2 symetrie a bylo zjištěno, že JASAN a CSH domény ACLY byly uspořádány podobně jako ACLY–citrát-CoA produktu a ACLY–OAA–acetyl-CoA struktur s r.m.s.d. hodnoty pro Ca atomy 0.584 a 0.620 Å, resp., Nicméně, na rozdíl od těchto ostatních substrátu a produktu komplexy, ACLY-E599Q–ATP-citrát-CoA komplexní odhalil pozoruhodně dobře definované kryo-EM hustota v POPEL doména aktivního místa, což může být modelován jako ADP (hydrolyzovaný ATP) a fosfo-citryl-CoA meziprodukty (Obr. 6a, b). Také, na rozdíl od každé jiné ACLY struktury uvedené v této studii, aminokyseliny 752-767 smyčky přechovávání H760 reziduum, které bylo prokázáno, že zprostředkovává přenos fosfátu z ATP citrát, je dobře uspořádaný v ACLY-E599Q–ATP-citrát-CoA strukturu (Obr. 6c)., Kromě toho je pozorováno, že iont hořčíku nebo molekula vody, také navržená ke stabilizaci H760, je vázána na e599 a fosfátovou skupinu(obr. 6c). Toto pozorování naznačuje, že zbytek His760, fosfátová skupina a iont hořčíku mohou spolupracovat na stabilizaci citrátu pro ligaci na CoA v aktivní oblasti popela. Kromě toho, skutečnost, že acetyl-CoA a OXALACETÁT produkty nejsou pozorovány v této struktuře dále podporuje naše závěry, že E599 hraje důležitou roli ve štěpení fosfo-citryl-CoA, meziprodukt na acetyl-CoA a OXALACETÁT výrobky ve POPELA domény.,