materiály a metody
myši.
myši divokého typu c57bl / 6 byly získány z laboratoří Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Myši PDE8A KO byly původně produkovány společností Deltagen, Inc. (San Carlos, CA) na základě smlouvy společnosti Pfizer, Inc. (Pfizer Global Research and Development, Sandwich, Velká Británie). Následně byli chováni na myši c57bl / 6 na Washingtonské univerzitě po dobu 10 generací. Pro hlášené experimenty byly použity myši odpovídající věku mezi 6 a 8 týdny věku., Všechny postupy byly schváleny Institucionální Animal Péče a Používání Výboru (IACUC) University of Washington, v souladu s National Institutes of Health Průvodcem pro Péči a Použití Laboratorních Zvířat.
PCR v reálném čase.
Varlat cDNA byla připravena z celkové RNA z wild-type a PDE8A-null myši varlat pomocí SuperScript III a Oligo dT (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). PCR v reálném čase bylo provedeno pomocí Power SYBR green master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA)., Primery (IDT, Coralville, IA) pro PDE8A, zaměřena na oblast následné cílení kazeta, byly následující: forward primer, GCCACAGAAATGACGAAGC (exon 19); reverzní primer, ATGTCTTCCAGACTTCTGTCAGG (exon 20). Primery pro hypoxanthin-guanin fosforibosyltransferázu byly následující: přední primer ATTATGCCGAGGATTGAA; reverzní primer, CCCATCTCTCTCATGACATCT.
in Situ hybridizace.
šablona pro syntézu riboprobe byla získána PCR použitím plazmidu obsahujícího myší pde8a sekvenci., Zejména na 3′ oblast myši PDE8A (exons 17-20) byl amplifikován pomocí následující primery: forward primer, AATTAACCCTCACTAAAGGACGGCGTATTTCCTTTCCAG (podtržené T3 fágové RNA polymeráza promotor sekvence); reverzní primer, TAATACGACTCACTATAGGGACACGTCGGCACACTTAAT (podtržené T7 fága RNA polymeráza promotor sekvence). Produkty PCR byly izolovány z agarózových gelů a čištěny pomocí gelové extrakční sady (Qiagen, Valencia, CA)., 35S-označené riboprobes byly syntetizovány in vitro transkripce s MAXIscript T3/T7 kit (Ambion, Austin, TX) tím, jak pomocí šablony PCR produkt obsahující T3 a T7 fága RNA polymeráza pořadatel stránky. In vitro transkripce byla provedena ve 20 µl reakční směsi obsahující 5 µl UTP (PerkinElmer, Boston, MA) a T3 RNA polymeráza nebo T7 RNA polymeráza získat sense nebo antisense riboprobe, resp.
Varlata byly vyjmuty z wild-type a PDE8A KO myší a byly rychle zmraženy v Tissue-Tek O. C. T. compound (Sakura, Torrence, CA) na suchém ledu., Sekce (20 µm) byly řezány v kryostatu, namontovány na SuperFrost Plus mikroslidu (VWR Scientific, West Chester, PA) a vysušeny vzduchem. Řezy byly fixovány v 4% paraformaldehydu po dobu 15 min při pokojové teplotě, zacházet s 0.25% acetanhydridu v 0,1 M triethanolamin (pH 8.0) na 10 min, a dehydratovaná přes odstupňované etanolové řadě (30, 60, 80, 95 a 100%). Řezy byly poté inkubovány s hybridizační pufr ve vlhké komoře při teplotě 60°C po dobu 4 h. Po opláchnutí ve 2 x SSC (standardní fyziologický roztok citrátu; 1× SSC = 0,15 M chloridu sodného/0,015 M citrát sodný, pH 7.,2), úseky byly dehydratovány pomocí tříděné řady ethanolu. Hybridizace byla prováděna v pufru obsahující 35S-označené „antisense“ nebo smysl sondy (40 pg/34,000–38,000 cpm za µl) pod plastové coverslips ve vlhké komoře při teplotě 60°C přes noc. Na coverslips byly jemně odstraněny a řezy byly promyty 2× SSC obsahující 10 mM DTT 30 min dvakrát na 60°C. řezy byly poté inkubovány 30 min při 37°C s 20 µg/ml RNaseA v 0,5 M NaCl, 10 mM Tris·HCl (pH 7.,5) a 1 mM EDTA, poté se promyje 50% formamid, 2× SSC obsahující 10 mM DTT po dobu 30 min při 60°C, v 1× SSC obsahující 10 mM DTT po dobu 30 min při 60°C, a dále v 0,1 x SSC obsahující 10 mM DTT po dobu 30 min při 60°C. Konečně, sekce byly dehydrataci v etanolu (70, 95 a 100%), suší se na vzduchu a vystaveny na BioMax XAR film (Eastman Kodak, Rochester, NY) pro 9 h. Vidět cele distribuce PDE8A mRNA hybridizace, snímky byly potažené Autoradiografie NTB emulze (Eastman Kodak) a vystaveny po dobu 1 týden při 4°C., Diapozitivy byly vyvinuty, fixovány a protilehlé hematoxylinem a namontovány v kanadském balzámu (Sigma-Aldrich).
Pde8a Immunoprecipitation and Assay.
Myší spermie byly izolovány z cauda epididymis tím, že plavat-out metoda (38) a homogenizuje v PBS obsahujícím 1% Nonidet (Roche Applied Science, Indianapolis, IN), 1 mM EGTA, 20 mM DTT, 0,2 mM PMSF, 1 mM para-amino benzamidine, a Sigma proteázy směs (Sigma-Aldrich)., V homogenátu byla centrifugována po dobu 5 min na 16000 × g v mikroodstředivce a 200 µl supernatantu, což odpovídá 106 spermií, byly inkubovány přes noc s 20 µl 1:1 suspenze protein G-agarózy korálky (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) v přítomnosti nebo nepřítomnosti protilátky PDE8A (1:100, 121-AP; Fabgennix, Frisco, TX). Další den, immunoprecipitate byl třikrát promyty PBS a poté testovány pro PDE aktivity v přítomnosti 10 nM tábor substrát, 40 mM Mopy (pH 7,5), 15 mM Mg-acetát, 2 mM EGTA, a 0,2 mg/ml BSA jako v ref. 39.,
Imunohistotochemie.
čerstvě zmrazené myší varlata byly vloženy do tkáně-Tek o. C. T. sloučeniny a poté rozděleny na kryostat při 20 µm na plátek. Tkáňové řezy nebo izolované Leydigovy buňky byly sušené a stanovena na 4% (hmot./obj.) paraformaldehydu/PBS (pH 7.4) při pokojové teplotě po dobu 10 min a třikrát promyty PBS. Snímky byly preincubovány blokujícím pufrem (5% oslí sérum, 1 mg/ml BSA a 0.,1% Triton X-100 v PBS) po dobu 1 h při pokojové teplotě inkubovány s anti-PDE8A protilátky (200 µl, 1:100, C-15; Santa Cruz Biotechnology) v PBS obsahujícím 1% oslí sérum, 1 mg/ml BSA, 0,1% Triton X-100 přes noc při 4°C, promyta v PBS obsahujícím 0.05% Tween 20 třikrát po dobu 20 min inkubovány s donkey anti-goat Alexa546 (200 µl, 1:500; Invitrogen) v PBS obsahujícího 1 mg/ml BSA a 0,1% Triton X-100 po dobu 2 h při teplotě místnosti a promyje., Snímky byly dále inkubovány s blokačním pufru obsahující 5% kozí sérum pro 1 h při pokojové teplotě inkubovány s cytochromu P450 straně řetězce štěpení enzymu (CYP11A) protilátky (200 µl, 1:250; Chemicon International Inc., Temecula, CA) přes noc při 4°C, promyta v PBS obsahujícím 0.05% Tween 20 třikrát po dobu 20 min a inkubovány s kozí anti-králičí Alexa488 (1:500; Invitrogen) jako výše. Řezy byly nakonec s kontrastním K-PRO-3 (1:1000; Invitrogen) v PBS po dobu 5 min, promyje, a namontované v SlowFade Gold antifade reagent (Invitrogen)., Test PDE8A protilátek specifičnost, roztok protilátek preinkubuje s 2,5 µg/ml antigen peptid (Santa Cruz Biotechnology) po dobu 2 h při pokojové teplotě před barvením. Některé sekce byly inkubovány bez primárních protilátek k určení pozadí v důsledku sekundárních protilátek. Imunostační signály byly vizualizovány konfokálním mikroskopem (Leica SL; Leica Microsystems Inc., Bannockburn, IL). aktivita β-galaktosidázy, vyjádřená jaderným lokalizačním signálem genem LacZ v cílené kazetě, byla hodnocena barvením X-gal., Řezy byly nejprve inkubovány s anti-CYP11A protilátek následuje anti-rabbit konjugátu alkalické fosfatázy (1:500; Invitrogen) a NBT/BCIP (Roche) pro barvu rozvoj. Barvení X-gal bylo poté provedeno tak, jak bylo popsáno (40) ve směsi X-gal při 37°C přes noc. Sekce byly promyty a namontovány pomocí glycerolu / Tris pufrovaného fyziologického roztoku.
čištění Leydigových buněk.
Leydigovy buňky byly izolovány, jak je popsáno v ref. 41. Stručně řečeno, varlata z dospělých myší byla dekapsulována a rozptýlena ve třepací vodní lázni při 34 ° C po dobu 10 minut v 10 ml média 199 (M-199) s 0.,25 mg/ml kolagenáza D, 35 mU/ml Dispase II, a 6 µg/ml Dnázy I. ukončit tkáně disperze, 40 ml 1% BSA v M-199 média obsahující 15 mM Hepes, 4 mM hydrogenuhličitanu sodného a 25 µg/ml soybean trypsin inhibitor byl přidán k ředění původní suspenze. Trubky byly poté několikrát zakryty a obráceny. Semenotvorných kanálků bylo dovoleno usadit gravitací, a supernatant obsahující intersticiální buňky byly shromážděny. Postup byl opakován dvakrát, aby se dále sklízely intersticiální buňky., Buňky byly peletovaného v 50-ml zkumavky centrifugací při 800 × g po dobu 20 min při teplotě 4°C a poté frakcionovány pomocí kontinuální Percoll (GE Healthcare, Piscataway, NJ) gradient (55% Percoll v HBSS pufrem, s 15 mM Hepes a 25 µg/ml soybean trypsin inhibitor) v celkovém objemu 35 ml. Přechody byly vytvořeny in situ odstředěním v JA-20 fixní úhel rotoru (Beckman Coulter, Fullerton, CA) v 23,700 × g po dobu 30 min při 4°C. zkumavky obsahující hustota marker beads (GE Healthcare) byl použit jako referenční identifikovat různé hustoty vrstev., Leydigovy buňky byly získány od hustoty 1,07 g/ml ke dnu gradientu. Pět svazků HBSS byly přidány k ředění Percoll, a buňky byly peletovaného při 200 × g po dobu 10 min při 4°C. poslední pelety získané ze dvou varlat, obohacený v Leydigových buněk, byly resuspendovány v 4 ml DMEM/F-12 doplněna s 1% BSA a ihned použit pro experimenty.
3β-Hydoxysteroid dehydrogenázový test.
měření produkce testosteronu.
Leydigovy buňky byly resuspendovány výše a alikvoty 100-µl byly vydávány v deskách 96-well., Buňky byly stimulovány v 150-µl konečný objem s uvedenými koncentracemi rekombinantního LH za 3 h v 5% CO2 inkubátoru při 37°C. Rekombinantní lidský LH byla získána z Národního Hormon & Peptid Programu (A. F. Parlow, Torrance, CA). Testosteron propuštěn do médií duplicitních buněk vzorků pro každou koncentraci LH byla měřena pomocí immunoenzymatic assay kit od Neogen (Lexington, KY).
všechna data jsou vyjádřena jako střední ± SD., Hodnoty EC50 pro LH akce na produkci testosteronu byly vypočítány nelineární montáž na koncentraci LH-závislost křivky získané pro každý Leydigových buněk, příprava pomocí software (GraphPad Prism 4.0; GraphPad Software, San Diego, CA). Statistickou analýzu provedl Studentův t test. Rozdíly byly považovány za významné při P < 0.05.