Madame Lelica

SSF koncept

myšlenka, provedení enzymatické hydrolýzy a fermentace současně předložila Gauss et al. v patentu z roku 1976 ., Autoři uvedli, že výtěžek glukózy v tradiční samostatné enzymatické hydrolýze (za použití enzymů produkovaných houbou Trichoderma reesei) byl nízký, pravděpodobně kvůli inhibici hydrolýzy konečným produktem glukózou a celobiózou. Autoři však mohli ukázat, že při použití SSF získali vyšší celkový výtěžek ethanolu, který připisovali odstranění glukózy a celobiózy fermentací a následnému uvolnění inhibice konečného produktu., Termín SSF (zkratka SSF se často používá také pro fermentaci v pevném stavu) nebyl v té době používán autory, ale stal se běžnou notací pro tento proces během několika let od původního vynálezu. Zamezení inhibice konečného produktu je stále pravděpodobně nejdůležitějším důvodem pro použití SSF, ale existuje několik dalších potenciálních výhod. Gauss a co-pracovníků, zmínil například tu výhodu, že glukóza nemusí být odděleny od ligninu frakce po samostatné enzymatické hydrolýzy kroku, čímž se zabrání případné ztráty cukru., Kombinace hydrolýzy a fermentace navíc snižuje počet potřebných nádob a tím i investiční náklady. Odhaduje se, že pokles kapitálových investic je větší než 20%. To je velmi důležité, protože lze očekávat, že kapitálové náklady budou srovnatelné s náklady na suroviny při výrobě ethanolu z lignocelulózy . Další výhody, týkající se co-spotřeba pentóza a hexóza cukrů a detoxikace se objevily v poslední době, jak bude popsáno později v této recenzi.,

nevyhnutelně existují také nevýhody SSF ve srovnání se samostatným procesem hydrolýzy a fermentace (SHF). Optimální teplota pro enzymatickou hydrolýzu je obvykle vyšší než teplota fermentace – alespoň při použití kvasinek jako fermentačního organismu. V procesu SHF může být teplota pro enzymatickou hydrolýzu optimalizována nezávisle na fermentační teplotě, zatímco v procesu SSF musí být nalezen kompromis. Kromě toho nelze kvasinky znovu použít v procesu SSF kvůli problémům s oddělením kvasinek od ligninu po fermentaci., Kvasinky proto nutně představují ztrátu výnosu v procesu SSF, pokud jsou kvasinky vyráběny ze sacharidů v procesu (viz Obrázek 1) nebo provozní náklady, pokud jsou externě dodávány. Enzymy jsou stejně obtížné znovu použít, také v procesu SHF. Enzymy jsou buď vyrobené v procesu (viz Obrázek 1) – což představuje úbytek substrátu nebo jsou externě dodávané a tím přidat do chemické náklady., Recirkulace enzymů je stejně obtížná, protože enzymy se váží na substrát, ačkoli částečná desorpce může být získána po přidání povrchově aktivních látek .

dostupnost zpracování lignocelulózové suroviny se liší v závislosti na geografické poloze (viz např., Kim a Dale ) a lignocelulosické suroviny jsou poměrně heterogenní, pokud jde o strukturu i chemické složení (viz tabulka 1). Tato heterogenita má silný vliv na proces designu, které ovlivňují prakticky všechny kroky procesu, tj. mechanické zpracování materiálu, předčištění podmínky, výběr enzymy a kmeny kvasinek, stejně jako rozdělení a vlastnosti zbývající lignin. To se projeví v níže uvedené diskusi.,

Předchozí

účelem předúpravy je změnit zpracování lignocelulózové struktury a zvýší rychlost enzymatické hydrolýzy především celulóza. To by mělo být provedeno s minimální tvorbou sloučenin, které inhibují fermentující mikroorganismy . Přístupná povrchová plocha je považována za jeden z nejdůležitějších faktorů ovlivňujících účinnost degradace enzymatické celulózy ., V nativním dřevu je enzymům přístupná pouze malá část kapilár buněčné stěny . Předčištění však zvyšuje dostupné oblasti v několika způsoby ; i) fragmenty a trhliny jsou tvořeny dávat větší oblast , ii) frakce hemicelulózy je hydrolyzovaný, což snižuje stínění účinky , iii) lignin také prochází strukturálními změnami, a dřevo je delignified v různé míře, v závislosti na předchozí technologie . Tak může být odstraněno stínění mikrofibril a okluze pórů způsobených ligninem., Další faktory, předpokládá, že ovlivňují stravitelnost v SSF, jsou substrátu krystaličnosti a stupeň polymerace (DP) .

předběžné zpracování metody lze rozdělit na fyzikální a chemické metody, a kombinace těchto dvou se běžně používají (viz např. recenzi napsal Mosier et al. ). Typ suroviny silně ovlivňuje výběr metody předběžné úpravy. Hemicelulóza je například acetylována do vysoké míry v materiálech bohatých na xylan., Od acetát je osvobozen během hydrolýzy, předčištění těchto materiálů je do jisté míry autokatalytická a vyžadují méně přidaného kyseliny a mírnější podmínky procesu. Uvolněný acetát však přispívá k toxicitě hydrolyzátů hemicelulózy.

Amoniaku vlákno/zmrazit výbuchu (AFEX) předčištění je považován za atraktivní metoda pro předčištění zemědělských zbytků, čímž se získá vysoce stravitelné celulózy . AFEX depolymerizuje lignin, odstraňuje hemicelulózu a dekrystalizuje celulózu ., Mírná teplota a pH také minimalizují tvorbu produktů degradace cukru. Metoda však trpí vysokými náklady na obnovu amoniaku a amoniaku . V této souvislosti je třeba také zmínit vápennou metodu založenou na hydroxidu vápenatém (nebo sodném). Alkalické předúpravy jsou provozovány při nižších teplotách po dlouhou dobu pobytu a pokud jde o metodu AFEX, získává se delignifikace biomasy.

parní exploze je intenzivně studovaná metoda předúpravy ., Účinky nekatalyzovaného výbuchu páry – a předběžných úprav kapalné teplé vody-na biomasu jsou primárně přičítány odstranění hemicelulóz. Přidáním kyselého katalyzátoru lze hydrolýzu dále zlepšit . Zřeďte kyselé předúpravy pomocí H2SO4 nebo SO2 jsou nejvíce zkoumané metody předúpravy kvůli jejich účinnosti a levnosti. Tyto metody byly použity v pilotních závodech, a proto se blíží komercializaci . Kyselina katalyzovaná léčba zlepšuje odstranění hemicelulózy, poskytuje částečnou hydrolýzu celulózy a mění strukturu ligninu ., Hlavní nevýhody se týkají požadavků na procesní zařízení a tvorby inhibitorů . Tak daleko, úspěšný pretreatments s alkalickými, AFEX a kapalné horké vody byly omezeny na zemědělských zbytků a travní plodiny , vzhledem k tomu, kyseliny, zásadité páry pretreatments přinesly vysoké výnosy v odvětví cukru z těchto materiálů, stejně jako z měkkého dřeva vstupních surovin .

jednoduchá kvantifikace tvrdosti procesu předúpravy páry je tzv., This factor combines the time and the temperature of a process into a single entity, R 0 = t ⋅ e T r − 100 14.75 MathType@MTEF@5@5@+=feaafiart1ev1aaatCvAUfKttLearuWrP9MDH5MBPbIqV92AaeXatLxBI9gBaebbnrfifHhDYfgasaacPC6xNi=xH8viVGI8Gi=hEeeu0xXdbba9frFj0xb9qqpG0dXdb9aspeI8k8fiI+fsY=rqGqVepae9pg0db9vqaiVgFr0xfr=xfr=xc9adbaqaaeGaciGaaiaabeqaaeqabiWaaaGcbaGaemOuai1aaSbaaSqaaiabicdaWaqabaGccqGH9aqpcqWG0baDcqGHflY1cqWGLbqzdaahaaWcbeqcfayaamaalaaabaGaemivaq1aaSbaaeaacqWGYbGCaeqaaiabgkHiTiabigdaXiabicdaWiabicdaWaqaaiabigdaXiabisda0iabc6caUiabiEda3iabiwda1aaaaaaaaa@403B@ ., U kyselých katalyzovaných pretreatments kombinovaný faktor závažnosti, log (CS), se někdy používá. To také bere v úvahu pH, log(CS) = log (R0) – pH a typické hodnoty pro kyselou katalyzovanou parní explozi předúpravy měkkého dřeva jsou v rozmezí 2 až 4 .

optimální podmínky předúpravy v procesu SSF se nemusí nutně lišit od podmínek SHF procesů využívajících lignocelulosickou biomasu. Nicméně, několik sloučenin přítomných v předčištění hydrolyzáty, které inhibují enzymatickou hydrolýzou jsou převedeny do kvasné organismy., Toto je pravděpodobné vysvětlení za vyššími vykazovanými výnosy ethanolu v SSF ve srovnání s SHF . Tvorba inhibitorů z předúpravy může být proto v procesu SSF tolerována ve vyšší míře. Inhibiční sloučeniny lze umístit do tří hlavních skupin; furaldehydy, slabé kyseliny a fenoly. Dva nejběžnější furaldehydy, HMF (5-hydroxymethyl-2-furaldehyd) a furfural (2-furaldehyd), se tvoří za těžkých podmínek z hexóz a pentóz ., Slabé kyseliny z lignocelulózových materiálů, jako je kyselina octová, mravenčí a levulinová, jsou tvořeny hlavně de-acetylací hemicelulózy nebo rozpadem HMF . Fenolické sloučeniny se tvoří hlavně během rozpadu ligninu a nacházejí se v mnoha variantách, v závislosti na typu ligninu . Pro podrobnější diskusi o inhibici viz např. recenze Almeida et al .

enzymatická hydrolýza

úspěšná Předúprava musí hemicelulózu do značné míry odstranit, takže celulóza je k dispozici pro hydrolýzu., Protože většina běžně používaných mikroorganismů pro výrobu etanolu pouze využít cukr monomery, celulóza musí být hydrolyzován, což v SSF se vyskytuje současně s fermentace. Historicky, průmyslové celulóza trávení byla provedena s kyselou hydrolýzou a optimalizace kyselé hydrolýze různých zpracování lignocelulózové materiály byly provedeny pro výrobu etanolu účely ., Kyselé hydrolýze, nicméně, vytváří produkt, které jsou relativně toxické pro fermentaci mikroorganismů, a maximální glukózy výnos je omezen na přibližně 60% v dávkovém procesu pro kinetickou důvodů . Enzymatická degradace frakce celulózy má naopak potenciál produkovat relativně netoxické hydrolyzáty s vyššími výtěžky cukru.

enzymy specializované na rozbíjení β-1-4-glykosidové vazby glukanu se souhrnně nazývají celulázy. V roce 1950 Reese et al představil model enzymatické celulózové hydrolýzy založené na více enzymech (C1 a CX)., Předpokládá se, že enzym C1 produkuje kratší polyanhydro-glukózové řetězce, zatímco solubilizace byla přičítána enzymu CX. V podstatě stejný obrázek platí dnes,ale došlo k obrovskému pokroku ve znalostech o všech různých specifických složkách enzymů. Celulázy jsou rozděleny do tří podkategorií, které představují tři typy aktivity: endoglukanázy, exoglukanázy (celobiohydrolázy) a β-glukosidázy., Endoglukanázy významně snižují stupeň polymerace substrátu náhodným napadením vnitřních částí, zejména v amorfních oblastech celulózy. Exoglukanázy (nebo celobiohydrolázy) naopak postupně zkracují molekuly glukanu vazbou na konce glukanu a uvolňováním hlavně celobiózových jednotek. Nakonec β-glukosidázy rozdělily disacharidovou celobiózu na dvě jednotky glukózy.,

Několik typů mikroorganismů může produkovat celuláza systémů, včetně aerobní vláknité houby, aerobní aktinomycety, anaerobní hyperthermophilic bakterie a anaerobní houby (viz např. recenzi Lynd et al. ). Intenzivní výzkum aerobních vláknitých hub T. reesei v posledních desetiletích vyústil v efektivní organismus produkující celulázu, který v současné době dominuje průmyslové produkci celulázy .

jak již bylo zmíněno, důležitou výhodou SSF ve srovnání s SHF je snížení inhibice konečného produktu cukry vytvořenými v hydrolýze., Fermentační produkt ethanol také inhibuje hydrolýzu, ale v menší míře než celobióza nebo glukóza . Další výhodou je, že inhibitory z předúpravy mohou být metabolizovány mikroorganismy . Proces SSF však může trpět neúplnou hydrolýzou pevné lignocelulosické frakce. Kromě inhibice end-produktů nebo jiných složek , to může být způsobeno enzymem spolujezdce, neproduktivní adsorpce enzymu , snížení dostupnosti konce řetězce , a zvýšit krystaličnosti s konverzí z předupravené celulózy .,

v průmyslovém SSF by koncentrace enzymů a buněk měly být vhodně vyváženy, aby se minimalizovaly náklady na produkci kvasinek a enzymů. Synergie mezi enzymy, např. endo-exo synergismus , exo-exo synergismu , a synergismus mezi endo – nebo exoglucanases a β-glucosidases , by také měly být optimalizované ladění složení enzymatických směsí. Optimální složení bude určitě záviset na lignocelulosické surovině.,

Kvasné mikroorganismy

obecné požadavky na organismus mají být použity v produkci etanolu je, že je třeba dát vysoký výnos etanolu, vysokou produktivitu a být schopen odolat vysoké koncentrace ethanolu v zájmu zachování destilace nízké náklady . Kromě těchto obecných požadavků je pro aplikace SSF nezbytná tolerance inhibitorů, teplotní tolerance a schopnost využívat více cukrů. Tolerance vůči nízkým hodnotám pH minimalizuje riziko kontaminace., Pracovní kůň při výrobě ethanolu na bázi škrobu nebo sacharózy je kvasnice běžných pekařů, Saccharomyces cerevisiae. Tento organismus produkuje ethanol s vysokým výtěžkem (vyšší než 0,45 g g-1 za optimálních podmínek) a vysokou specifickou rychlostí (až 1,3 g-1 buněčná hmota h-1 ). Má také velmi vysokou toleranci ethanolu, u některých kmenů a médií bylo hlášeno více než 100 g L-1 . Kromě toho se organismus ukázal jako robustní vůči jiným inhibitorům, a proto je vhodný pro fermentaci lignocelulózních materiálů .,

hemicelulóza z tvrdého dřeva a zemědělské zbytky jsou obvykle bohaté na xylany (srov. Tabulka 1) – tvrdé dřevo obsahující především o-acetyl-4-O-methyl-glukuronoxylan, zatímco trávy obsahují arabinoxylan . Na druhé straně hemicelulóza měkkého dřeva obsahuje více mannanů – především ve formě na galaktoglucomannanu – a méně xylanu. Manózová fermentace je obvykle účinná u s., cerevisiae, zatímco schopnost kvasit galaktózu je závislá na kmeni a geny pro využití galaktózy jsou dále potlačovány glukózou , což vede k typickému sekvenčnímu využití cukrů. Je zřejmé, že fermentace xylózy je významnějším problémem pro zemědělské zbytky a tvrdé dřevo než pro měkké dřevo. Xylóza není metabolizována divokým typem s. cerevisiae, kromě menšího snížení na xylitol. To, a pro některé části teplotní tolerance, byly hlavním důvodem zájmu testovat i jiné mikroorganismy pro konverzi lignocelulózy v SSF.,

přirozeně kvasící kvasinky xylózy, jako je Pichia stipitis a Candida shehatae , by mohly být potenciálně výhodné použít v SSF materiály s vysokým obsahem xylanu. Jejich tolerance k inhibičním sloučeninám v nedetexifikovaných hydrolyzátech lignocelulózy je však poměrně nízká a navíc je pro efektivní fermentaci xylózy vyžadován velmi nízký a dobře řízený přísun kyslíku . Hlavními „konkurenty“ kvasinek byly bakterie zymomonas mobilis a geneticky upravená Escherichia coli. Z., mobilis, povinně anaerobní bakterie, která postrádá funkční systém pro oxidační fosforylaci, produkuje ethanol a oxid uhličitý jako hlavní fermentační produkty. Zajímavé je, že z. mobilis využívá cestu Entner-Duodoroff, která poskytuje nižší produkci ATP na katabolizovanou glukózu . To zase dává nižší výtěžnost biomasy a vyšší výtěžnost ethanolu na glukóze ve srovnání s s .cerevisiae. Nicméně, divoký typ z. mobilis postrádá schopnost kvasit pentózové cukry, a hlavní nevýhodou je, že to není příliš robustní organismus., Obecně se zdá, že bakterie jsou méně tolerantní k inhibitorům odvozeným od lignocelulózy a před fermentací může být zapotřebí detoxikační krok. Na rozdíl od pekařského droždí a Z. mobilis, E. coli je schopen metabolizovat širokou škálu substrátů (včetně hexoses, pentoses a laktózy), ale wild-type organismus má smíšené fermentativní cesta, a je tedy chudý výrobce ethanolu. V orientačním příspěvku, uděleném americkým patentovým číslem 5000000, kmen E., coli geneticky upravené na ethanol výrobce tím, že zvýšená exprese PDC (kódování pyruvát dekarboxylázu) a adhB (kódování alkohol dehydrogenáza) od z. mobilis . Vynikající výsledky byly dosaženy s rekombinantní E. coli, např. KO11 napětí, které ukázaly, ethanol výnosy z 86 na téměř 100% teoretické a konečné koncentrace ethanolu až 40 g. L-1 na hemicelulózy produkt bagasa, kukuřičná píce a kukuřice slupky ., Nicméně, pouze kapalná frakce byla použita v hlášených studiích, a hydrolyzáty byly dále detoxikován před použitím v overliming na pH 9 s hydroxidem vápenatým a poté upravena na pH 6.0–6.5 s HCl. Kromě toho, protože optimální pH je 6,5, E. coli je méně vhodný pro SPOJOVACÍCH procesů s T. reesei cellulases, který je obecně považován za pH optimum kolem 4.8 .

Pentózová fermentace inženýrství s. cerevisiae

vzhledem k velmi atraktivním vlastnostem s., cerevisiae v průmyslové kvašení, tam byly významné úsilí v posledních desetiletích se konstrukce rekombinantní xylózy a arabinózy kvasných kmenů této kvasinky. Xylózy kvasící kmeny S. cerevisiae mohou v zásadě být konstruovány buď vložením genů kódujících xylózy izomeráza (XI) od bakterií a hub , nebo geny kódující reduktázy xylózy (XR) a xylitol dehydrogenáza (XDH) z hub . Také endogenní Gen xks1 kódující xylulokinázu (XK) musí být přeexpresován, aby se dosáhlo významné fermentace xylózy ., Transportní proteiny jsou potřebné pro příjem xylózy, stejně jako jiných cukrů v kvasinkách. V S. cerevisiae, xylózy bylo zjištěno, že být přepravován na hexóza transportéry, , ale afinita pro xylózy je přibližně 200-krát nižší než u glukózy . V důsledku toho je příjem xylózy kompetitivně inhibován glukózou.

k Dispozici je 20 různých genů kódujících cukru dopravy související proteiny, 18 jednotlivých systémů (Hxt1-17 a Gal2) a dvě související signální proteiny (Snf3p a Rgt2p)., Transportéry vykazují různé afinity pro cukry a exprese jejich odpovídajících genů je regulována koncentracemi cukru, tj. dostupnost zdroje uhlíku . Již dříve bylo navrženo, že xylóza je přijímána jak systémy s vysokou a nízkou afinitou transportérů glukózy (Obrázek 2), ale příjem se zvyšuje za přítomnosti nízkých koncentrací glukózy . Studie ukázaly, že vysoké a střední afinitu hexóza transportéry; Hxt4, Hxt5 Hxt7 a Gal2 jsou ve skutečnosti nejdůležitější transportéry pro xylózy ., Dále bylo prokázáno, že pro účinné vychytávání xylózy je v médiu nutná nízká (ale nenulová) koncentrace glukózy . To bylo vysvětleno tím, že potřeba glukózy pro výraz glycolytic enzymy a meziprodukty , stejně jako generace zprostředkovatel metabolitů pro první kroky z xylózy metabolismus a pentózového cyklu . Další možné vysvětlení, odvozený z obou experimentů a počítačového modelování, je, že glukóza je potřebná pro výraz hexózy transportéry s příznivým xylózy transportní vlastnosti, např. Hxt4 ., V důsledku toho, s cílem získat efektivní co-kvašení xylózy a glukózy v SSF (někdy označován SSCF – simultánní zcukernatění a co-fermentace) s rekombinantní S. cerevisiae, je nutné, aby koncentrace glukózy v krvi nízká, což bylo prokázáno v praxi v posledních SPOJOVACÍCH studií .