estrutura de ACLY com CoA revela conformações de CoA produtivas e improdutivas
1a, b)., A fluorimetria diferencial de varrimento da enzima com diferentes cofactores confirmou a ligação e as potenciais alterações estruturais associadas aos ligantes adicionados isoladamente ou em combinação(Extended Data Fig. 1c). Utilizámos estes dados para orientar a determinação da estrutura de ACLY com os seus co-substratos ou co-produtos.preparámos a proteína recombinante e, inicialmente, efectuámos uma análise de uma única partícula negativa da proteína na ausência de quaisquer metabolitos (ACLY-apo)., A classe bidimensional (2D) é uma média de 3.000 partículas que confirmaram que a proteína formou um tetrâmero (dados estendidos Fig. 2a, b). Para obter mais detalhes estruturais, realizamos um estudo crioem sobre o complexo ACLY–citrato-CoA. Após múltiplas rodadas de otimização das amostras crio-EM, determinamos a estrutura crio-em D2 simétrica da estrutura ACLY–citrato-CoA para uma resolução global média de 3.0 Å. (Extended Data Figs. 2c, d, 3 e 4 e Quadro 1).,
O ACLY–citrato-CoA estrutura forma um homotetramer com uma central de tetrameric CSH módulo e dois ASH domínios em extremos opostos do CSH (módulo de protomers 1 & 2 e 3 & 4) (Fig. 1a, b). O domínio das cinzas (resíduos 1-806) adopta uma estrutura muito semelhante à arquitectura α/β anteriormente relatada do domínio N-terminal isolado ligado ao citrato e ao ADP24., O domínio CSH (resíduos 859-1101) é composto exclusivamente de hélices e loops curtos, com homologia estrutural para um dímero de dimeros de citrato sintase que cruzam a ~90° ângulos (dados estendidos Fig. 5a). Os domínios ASH e CSH de cada cadeia polipeptídica estão ligados por uma região de bobina de cerca de 50 resíduos, com excepção de uma pequena hélice α entre os resíduos 824 e 829. A região helicoidal dentro deste linker é o único ponto de contato significativo (pela interação de van der Waals) entre os dois domínios de cinzas de um lado da molécula., O linker estendido permite ao CSH de uma subunidade interagir com o domínio de cinzas de outra subunidade através do lado oposto do módulo CSH. Em contraste com as interações relativamente esparsas entre os PROTÔMEROS de cinzas, os domínios de CSH formam uma extensa rede de interações predominantemente de van der Waals que sugerem que os domínios de CSH funcionam como um módulo tetramérico rígido, enquanto os quatro domínios de cinzas são mais flexíveis. Isto é consistente com a estimativa de resolução local observada no mapa EM Sendo maior no domínio CSH (2.8 Å, dados estendidos Fig., 4c) e as nossas observações anteriores de que o domínio CSH tem uma temperatura de fusão mais elevada em relação à cinza de ~75 °C versus ~55 °C, respectivamente 21.
CoA liga-se na interface entre os domínios CSH e ASH de subunidades separadas e parece “agrafar” as superdomainas juntas. A base de adenina e o anel ribose interagem com o domínio CSH de um monómero e o braço pantoténico e o grupo β-mercapto aderindo Ao local activo do domínio de cinzas de outra subunidade (Fig. 1c (esquerda)e Fig. 1d (esquerda))., Modelagem do CoA é baseada na observação de que o Grupo ADP fosforilado é bem resolvido na densidade crioem. No entanto, o grupo mercapto não foi bem resolvido, sugerindo flexibilidade desta região. Embora vários resíduos de domínios CSH e ASH fazem com que as interações de van der Waals com CoA, ligações de hidrogênio de S574, R576 e S577 do domínio ASH e K964 do domínio CSH para o oxygens fosfato ribose pareçam desempenhar um papel particularmente importante na agrafação CoA na interface ASH–CSH., Curiosamente, E599 está dentro da distância de ligação de hidrogênio para o átomo de enxofre modelado de CoA, implicando que ele pode desempenhar um importante papel catalítico. A importância das interações proteína–CoA do domínio ASH e CSH é suportada pela sensibilidade mutacional dos resíduos R576 e K964, e o potencial papel catalítico do e599 é suportado pela sua sensibilidade mutacional a A ou Q mas não A D (Fig. 1f). Embora o citrato tenha sido incluído na amostra para reconstrução crio-EM, não poderia ser resolvido com confiança no mapa crio-EM.,dada a densidade não resolvida para o grupo mercapto de CoA, realizamos outra reconstrução da estrutura de ACLY–citrato-CoA sem impor simetria D2 para determinar se CoA poderia adotar diferentes conformações em diferentes protômeros. Conseguimos preparar uma reconstrução sem impor simetria (C1, assimétrica fechada) a uma resolução nominal de 3,5 Å. Nesta estrutura fechada assimétrica de ACLY-citrato-CoA-C1, a resolução em torno do domínio de cinzas é mais pobre do que na estrutura D2, mas a resolução local em torno do domínio CSH permanece relativamente alta, de 2,8 a 3,2 Å., A análise desta estrutura fechada assimétrica de ACLY–citrato-CoA-C1 revelou que cada um dos domínios de cinzas, e três dos quatro domínios CSH e moléculas CoA, adotaram a mesma configuração que a estrutura D2. No entanto, uma das moléculas de CoA adota uma conformação alternativa na qual a fracção fosforilada de ADP é deslocada ~8 Å para o módulo CSH e o braço pantotênico é dobrado para interagir com a CSH (Fig. 1b, c (direita) e Fig. 1e). A densidade crio-EM correspondente a esta conformação de CoA alternativa é muito clara (Fig. 1c (direita))., Notavelmente, o cryo-EM densidade também é observada para um bem-ordenada molécula de água, que aparece a ponte de ligação de hidrogênio interações entre o terminal de enxofre átomo de CoA com a cadeia lateral de resíduos de H900, D1026 e R1065 com adicional de van der Waals interações de L969, I973, H975 e R976 (Fig. 1d (direita)). Concomitante com esta conformação de CoA alternativa, um laço dentro do domínio CSH (resíduos 965-986) e as hélices de flanco mudam para acomodar a posição alternativa da base de COA adenina (Fig. 1e)., As mutações de H975, R976, D1026 e R1065 à alanina mostram actividade comprometida, sugerindo que a ligação de CoA ao Domínio CSH está de alguma forma envolvida na actividade enzimática (Fig. 1f). Dado que a CoA tem de reagir com citrato no domínio das cinzas, referimo-nos às conformações da CoA com a cisteamina do braço pantoténico que aponta para as conformações de CoA “produtivas” e “improdutivas”, respectivamente, ligadas a ACLY.,
a Estrutura do ACLY–citrato-CoA subpopulação revela assimétrica de CINZAS orientações
além dos principais ACLY–citrato-CoA de partículas população, o que representa 57% da classe 3 partículas, uma subpopulação de ACLY–citrato-CoA complexo de partículas que representa 23% da subclasse das partículas (10% do total) também foi capturado em uma reconstrução 3D, sem a imposição de simetria para uma resolução de 4,3 Å (Extended Data Fig. 3)., Esta subpopulação de partículas tem uma estrutura global que é semelhante à maior população de ACLY-citrato–CoA, exceto que um dos quatro domínios de cinzas é rodado ~50° em direção à sua subunidade de cinzas mais próxima para adotar uma conformação mais “aberta”, então nos referimos a ele como “ACLY-citrato-CoA-C1 asymm open”. Nesta estrutura, a densidade só é visível para a fracção fosforilada ADP de duas moléculas de CoA ligadas a dois dos domínios de cinzas simétricos(Fig. 2a, b). Uma das subunidades simétricas e assimétricas de cinzas não mostra nenhuma evidência de ligação CoA., Notavelmente, o domínio das cinzas assimétricas parece incompatível com a Coa produtiva (Fig. 2c). Propomos que esta estrutura aberta ACLY–citrato-CoA-C1 asymm represente um estado intermediário da ACLY, onde dois locais activos são preparados para catálise e dois não. A observação desta estrutura sugere também que os quatro locais activos podem funcionar de forma independente.
a, estrutura global de ACLY–citrato-CoA-C1 contendo a subunidade de cinzas assimétricas e destacando as duas moléculas de CoA ligadas em verde. Uma visão ampliada de um dos dois locais de ligação CoA com a densidade crio-EM correspondente é mostrado. B, sobreposição das estruturas simétricas (D2) e assimétricas (C1 asymm open) ACLY–citrato-CoA., c, sobreposição da CoA como ligada na estrutura simétrica de ACLY–citrato-CoA (D2) à subunidade de cinzas assimétricas da estrutura de ACLY–citrato-CoA (C1 asymm open), ilustrando que a subunidade assimétrica de cinzas é incompatível com a ligação CoA produtiva. Superfícies neutras, eletropositivas e eletronegativas da estrutura de ACLY são coloridas branco, azul e vermelho, respectivamente.,
a Estrutura do ACLY-apo estado é desfavorável para a CoA ligação
Dada a limitada interações entre CSH e CINZAS domínios, nós inquiriu sobre a estrutura de ACLY na ausência de ligação de ligantes. Para isso, determinamos a estrutura crio-EM de ACLY na forma apo, que fomos capazes de resolver para a resolução 4.3-Å (dados estendidos Figo. 4a e Quadro 1)., Uma comparação das estruturas de ACLY–apo e ACLY–citrato-CoA revela que, no estado da apo, cada um dos pares de cinzas em extremidades opostas do tetrâmero são rodados em direção uns aos outros por ~10° para formar um tetrâmero mais aberto e colocar os domínios de cinzas em posições que parecem desfavorecer a ligação CoA produtiva (Fig. 3). Especificamente, os loops de cinzas centrados em F533, S574 e K1018 (do domínio CSH adjacente) colidiriam com CoA como ligados na estrutura ACLY–citrato-CoA (Fig. 3b)., In addition, the two residues that are within hydrogen-bonding distance to CoA from the ASH domain, R576 and E599, move out of hydrogen-bonding distance in the ACLY-apo structure (Fig. 3c). Enquanto isso, o módulo CSH permanece praticamente inalterado entre as duas estruturas. Em conjunto, uma comparação das estruturas ACLY-apo e ACLY–citrato-CoA revela que a estrutura ACLY-apo deve reorganizar-se para acomodar o substrato CoA.
a, Sobreposição de ACLY-apo (laranja) e ACLY–citrato-CoA (verde). CoA é mostrado em magenta. b, Close-up do CoA extraído do ACLY–citrato-CoA estrutura sobreposta a ACLY-apo estrutura, ilustrando significativos confrontos do Côa, o que poderia ocorrer com unliganded ACLY, particularmente com resíduos F533 e K1018., c, visualização Ampliada em torno de CoA da superposição dos ACLY-apo e ACLY–citrato-CoA estruturas, destacando-se o movimento de R576 e E599 de ACLY-apo para ACLY–citrato-CoA estruturas para dentro de hidrogênio a ligação de distância do CoA.
ACLY–acetyl-CoA–OAA complexo revela CoA–citrato liase reação ocorre nas CINZAS de domínio
Diferencial de varredura fluorimetry dados revelou que tanto a acetil-CoA e OAA produtos estabilizado o ACLY proteína (Extended Data Fig. 1c)., Este achado indicava que poderíamos capturar o complexo de produtos ACLY–OAA–acetyl-CoA, e assim entender melhor o mecanismo de reação. Para este fim, determinamos a estrutura crio-em do complexo, que resolvemos para resolução 3.1-Å usando simetria D2 (Figo de dados estendido. 4). A estrutura geral do ACLY–co-produto do complexo foi mais semelhante ao simétrica ACLY–co-substrato (ACLY–citrato-CoA-D2) complexo, com um total de root-mean-square desvio (r.m.s.d.) de 0.407 Å para Ca átomos (Fig. 4a)., Descobrimos que Acetil-CoA ocupava o mesmo local de ligação que CoA e também era estabilizado pelos mesmos resíduos básicos, R576 e K964 (Fig. 4b). Além disso, fomos capazes de modelar inequivocamente duas moléculas OAA ligadas a cada subunidade ACLY (Fig. 4b, c). Uma molécula de OAA (OAA1) sobrepõe-se à bolsa de ligação do citrato dentro do domínio das cinzas e proximal ao grupo acetilo do acetil-CoA. OAA1 faz interações relativamente modestas com a proteína, incluindo ligações de hidrogênio para n346 e T348 e interações de van der Waals com F547., A outra molécula de OAA (OAA2) está ligada ao Domínio CSH e faz interações mais extensas com ACLY do que OAA1. OAA2 contatos CSH módulo, através de ligações de hidrogénio para H900, D1026, R1065 e R1085 e através de interações de van der Waals para F935 e F1061 de uma subunidade, bem como através de uma ligação de hidrogênio para R1065 de outra subunidade (Fig. 4c). O OAA2 sobrepõe-se bem com o OAA ligado no citrato de coração de porco sintase25 (dados EXTENDIDOS Fig. 5b).
a, Comparison of ACLY–citrato-CoA (gray) and ACLY–OAA–acetyl-CoA (aqua) structures. As moléculas de acetil-CoA ligadas (púrpura) e OAA 1 e 2 (amarelas) são mostradas na renderização de CPK. b, vista ampliada da superfície eletrostática da ACLY em torno dos locais de ligação CoA e OAA, destacando os ligantes (varas) ligados e a densidade crio-EM correspondente (malha). São apresentados os principais resíduos que interagem com os metabolitos associados., c, Close-up view of hydrogen-bonding and van der Waals interactions with OAA1 (left) and OAA2 (right). d, gráfico da alteração de fluorescência em estado estacionário da ACLY em função do aumento das concentrações de citrato na ausência (azul) ou presença (laranja) de 200 µM CoA. Linhas sólidas mostram o melhor ajuste a um modelo de ligação de um único site. e, Plot of the steady-state fluorescence change of ACLY as a function of increasing concentrations of OAA. As linhas sólidas exibem o melhor ajuste para um modelo de ligação de um site (Azul) e um modelo de ligação de dois sites (laranja)., Os dados em d E e são traçados como erro médio ± padrão da média gerada a partir de experiências independentes n = 4 e estão disponíveis como dados de origem.,
Fonte de dados
Nós também aperfeiçoou a cryo-EM mapa de ACLY–OAA–acetil-CoA estrutura, sem restrições de simetria e obtida uma estrutura idêntica com o D2 simetria, exceto que um dos quatro acetil-CoA moléculas mostrou duas possíveis conformações do pantothenic braço de acetil-CoA, um com o cysteamine de CoA para o ASH de domínio, como em outros três protomers, e o outro para o CSH domínio (Extended Data Fig. 6a)., No entanto, ao contrário da conformação alternativa de CoA encontrada na estrutura de ACLY–citrato-CoA, a posição do Grupo ADP fosforilado não mudou nestas duas conformações. A potencial conformação alternativa do acetil-CoA poderia sugerir uma possível via de libertação do substrato na rotação enzimática ou um estado auto-inibitório da enzima (discutido abaixo).
a observação dos produtos OAA1 e acetil-CoA no domínio das cinzas sugere fortemente que a química da liase é realizada lá, em contraste com propostas anteriores de que esta química é realizada na CSH domain22,23., Nós especulamos que OAA2 pode funcionar para ajudar a organizar o CSH domínio para a cooperação com o ASH de domínio e/ou agir como uma segunda OAA produto autoinhibitory site que poderia seqüestrar o pantothenic braço de acetil-CoA (ou o cysteamine de CoA) para sentar em frente CSH, de domínio, de tal forma que mutuamente exclusivos ligação de CoA produtiva conformação é inibida em alta celular OAA concentrações (Extended Data Fig. 6a)., Curiosamente, enquanto a produtiva orientação CoA estendida com a cisteamina apontando para o domínio da cinza não pode ser modelada em ACLY-apo sem choque estérico significativo(Fig. 2b), a orientação invertida com a cisteamina apontando para o domínio CSH pode (Extended Data Fig. 6b). Isto é consistente com as nossas descobertas de que a CoA é capaz de se ligar à ACLY na ausência de citrato e/ou ATP (dados não mostrados), mas propomos uma conformação dobrada, como observado em um dos protômeros da ACLY–citrato-CoA-C1 (Fig. 1c (direita)e Fig., 1d (direita)) e também a estrutura isolada do csh domain22.um estudo anterior demonstrou que a OAA é capaz de inibir o fígado de rato de uma forma que não é competitiva com o citrato 26. Para validar o significado funcional dos dois locais de OAA observados na estrutura de ACLY–OAA–acetil-CoA, empregamos um experimento de extinção de fluorescência em estado estacionário., Como controle do experimento, primeiramente, titulada de citrato em ACLY na ausência ou presença de um saturar a concentração de CoA e foram capazes de ajustar os dados para uma citrate sítio de ligação com os valores de Kd de 3,4 ± 0,5 µM e 1,4 ± 0,3 µM, na ausência ou presença de CoA, com bons valores de R2 de 0,92 e, respectivamente, 0,84, respectivamente (Fig. 4d). Isto é consistente com o citrato de ligação local observado no ACLY ASH domínio da estrutura cristalina vinculado a citrate13 e a estrutura cristalina do intacta ACLY vinculado a CoA e citrate22, mostrando que CoA estabiliza citrato de ligação de ACLY ASH domain22., Em seguida, titulou OAA em ACLY e descobriu que os dados se encaixam significativamente melhor para um modelo de dois locais (R2 = 0.99) do que um modelo de um local (R2 = 0.93) (Fig. 4e). O modelo de ligação de dois locais melhor acomodou a diminuição da fluorescência bifásica que se torna aparente em concentrações mais elevadas de OAA e dá origem a um local de ligação OAA de alta afinidade (Kd = 15 ± 4 µM) que representa um terço da mudança total de fluorescência e um local de ligação OAA de baixa afinidade (Kd = 1300 ± 500 µM) que representa os dois terços restantes da alteração total de fluorescência (Fig. 4e)., Estes dados são consistentes com a relevância funcional dos dois locais de ligação às OAA observados na estrutura de ACLY–OAA–acetil-CoA.
ACLY–E599 está em posição de funcionar como um importante resíduo catalítico
a estrutura de ACLY-co-produto permitiu-nos abordar uma questão de longa data sobre o mecanismo molecular de ACLY. ACLY é proposto para clivar o intermediário citril-CoA com a ajuda de uma base geral para extrair um próton do substrato citrato e/ou um ácido geral para reprotonar a OAA deixando o grupo 16,27,28., Isto é consistente com uma análise do perfil de pH da ACLY com um pKa de ~8.5 (Fig. 5a). Nós hipotetizamos que a evolucionariamente conservada E599 é posicionada para desempenhar um papel catalítico importante, como uma base geral e/ou ácido, e/ou para estabilizar o intermediário fosfo-citril-CoA (ver seção seguinte e Fig. 4b). Um pKa relativamente alto para um resíduo de glutamato enterrado foi observado anteriormente 29. Consistente com um importante papel catalítico para o E599, descobrimos que os mutantes e599a e E599Q têm uma atividade significativamente comprometida (Fig. 1f), apesar de a ligação do cofactor não ter sido afectada (Fig. 5b)., Em contraste, descobrimos que um mutante ácido semelhante e599d exibia atividade semelhante à WT ACLY (Fig. 1f), com um perfil de pH semelhante (Fig. 5a). Em conjunto, os dados argumentam pela importância do E599 para a catálise por ACLY.
a, pH rate profile of ACLY-WT and ACLY-E599 mutants (mean ± standard deviation, n = 3 technical replicates)., b, Calorimetria diferencial de varrimento da ACLY-WT ou ACLY-E599A, com ou sem citrato e cofactores CoA (média ± desvio-padrão, n = 2 replicados técnicos). A linha tracejada indica a temperatura média de fusão (Tm) para a ao ACLY. Os dados para a e b estão disponíveis como dados de origem.,a identificação do e599 como um importante resíduo catalítico para a clivagem do aduto citril-CoA para os produtos acetil-CoA e OAA proporcionou-nos a oportunidade de apanhar um produto intermédio da reacção de um mutante acly-e599q na presença de co-substratos de ATP, citrato e coa., Nós, portanto, misturado a ACLY-E599Q mutante com saturar as concentrações de ATP, citrato e CoA (ACLY-E599Q–ATP-citrato-CoA) e determinar a sua cryo-EM estrutura, o que fomos capazes de resolver de uma resolução geral do 2.85 Å. A estrutura foi determinada por imposição de D2 simetria e revelou que o ASH e o CSH domínios de ACLY foram dispostos de forma semelhante ao ACLY–citrato-CoA produto e ACLY–OAA–acetil-CoA estruturas com r.m.s.d. valores para Ca átomos de 0.584 e 0.620 Å, respectivamente., No entanto, em contraste com estes outros substratos e complexos de produtos, o complexo ACLY-E599Q–ATP-citrato-CoA revelou uma densidade crio-EM notavelmente bem definida no sítio activo do domínio das cinzas, que poderia ser modelado como ADP (ATP hidrolisado) e um intermediário fosfo-citrilo-CoA (Fig. 6a, b). Além disso, em contraste com cada uma das outras estruturas de ACLY relatadas neste estudo, o loop de aminoácido 752-767 abrigando o resíduo H760, que tem sido mostrado para mediar a transferência de fosfato de ATP para citrato, é bem ordenado na estrutura de ACLY-E599Q–ATP-citrato-CoA (Fig. 6c)., Além disso, um íon magnésio ou molécula de água, também proposto para estabilizar H760, é observado estar ligado a E599 e ao grupo fosfato(Fig. 6c). Esta observação sugere que o resíduo de His760, grupo fosfato e íon magnésio podem cooperar para estabilizar o citrato para ligação a CoA no local ativo do domínio de cinzas. Além disso, o facto de os produtos acetil-CoA e OAA não serem observados nesta estrutura corrobora ainda as nossas conclusões de que o E599 desempenha um papel catalítico importante na clivagem do produto intermédio fosfo-citril-CoA aos produtos acetil-CoA e OAA no domínio das cinzas.,
a, estrutura global da estrutura de ACLY-E599Q–ATP-citrato-CoA, destacando o ADP ligado (ATP hidrolisado) e o intermediário fosfo-citril-CoA. b, Close-up do intermediário fosfo-citril-CoA, com a densidade crio-em correspondente. c, ampliada vista das interações proteicas proximal ao intermediário fosfo-citril-CoA., São apresentados resíduos que mediam ligações de hidrogénio ou interacções de van der Waals com o intermediário fosfo-citrilo-CoA.