Existem quatro famílias de intracelulares proteolíticas complexos onipresente em eubacteria: Lon, HslUV (ClpQY), ClpXP e FtsH. Além destes cinco, o HtrA (DegP) é um complexo proteolítico periplásmico/secretado, enquanto o proteosoma procariótico é encontrado apenas em actinomycetes. A estrutura, a função e o papel na patogénese de cada protease foram revistos previamente.,13, 17 vários destes complexos foram investigados como alvos antibacterianos potenciais, incluindo Lon, 18 ClpXP, 19 HtrA20 e o proteosoma.21 destes, o ClpXP tem sido investigado de forma mais extensa e é o único complexo para o qual foram encontrados inibidores naturais do produto até agora.
o complexo proteolítico da clp
As Clpp são bem conservadas na maioria das espécies bacterianas e têm um papel importante na rotação das proteínas., Além da homeostase proteica e degradação de proteínas mal dobradas, o ClpP também está envolvido em inúmeros processos regulatórios, visando reguladores transcritionais e remodelação do proteoma.22, 23, 24, 25 na verdade, a ClpP tem tido um papel fundamental na regulação de processos como a divisão celular, tolerância ao estresse, virulência, diferenciação morfológica e resistência aos antibióticos.22, 23, 24 O papel do ClpP nestes processos depende de sua estrita seleção de substratos proteicos, que ele consegue restringindo o acesso aos seus locais catalíticos., Cada complexo ClpP é formado por empilhar dois anéis heptaméricos para criar um tetradecamer (Figura 2).26 o canal formado abriga 14 sítios catalíticos da protease serina que não podem ser acedidos sem passagem através das aberturas axiais. Além disso, apo-ClpP adota uma conformação inativa e comprimida na qual sua tríade catalítica é desalinhada.27 controlar a ativação conformacional e o acesso a aberturas axiais são proteínas Hsp100 da superfamília AAA+ de ATPases: ClpA ou ClpX em bactérias Gram-negativas e ClpC ou ClpX em Gram positivos., Estas ATPases acessórias formam anéis hexaméricos que ligam as faces axiais do tetradecâmero usando motivos gf de tripéptido (L/I) que se encaixam em bolsas hidrofóbicas.28 a ligação neste bolso hidrofóbico regula a actividade do ClpP de duas formas: em primeiro lugar, estabilizando o complexo numa conformação activa e prolongada com a tríade catalítica alinhada e, em segundo lugar, através do desenvolvimento de substrato de proteína., A AAA+ ATPases interagem com alvos proteicos, quer directamente quer através de uma proteína adaptadora cooperante, e utilizam a energia fornecida pela ATP para desdobrar o substrato e alimentá-lo no poro central, onde é hidrolisado de forma independente da energia. Como as proteínas dobradas são grandes demais para entrar no canal, estes parceiros AAA+ regulam firmemente quais substratos de proteínas são direcionados para a degredação.28
Mecanismos de perturbar a ClpP proteolíticas do sistema., a) os tetradecamers ClpP (mostrados a vermelho) que abrigam os locais proteolíticos da serina (mostrados a verde) são rigorosamente regulados pelos hexamadores Hsp100 ATPase (mostrados a azul). (B-d) drogas (mostradas em amarelo) podem causar perturbação de uma de três maneiras, levando à morte celular ou reduzida virulência. Pensa-se que os fármacos que activam a actividade da ATPase do ClpC1 no M. tuberculosis (d) podem dissociá-lo do ClpP, inibindo a proteólise ou conduzindo a um aumento da degradação proteica. Uma versão completa desta figura está disponível no Journal of Antibiotics journal online.,
a Maioria das espécies bacterianas, incluindo E. coli, Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus, têm um gene clpP que, juntamente com seus associados AAA+ ATPases, são não essenciais para a viabilidade da célula.No entanto, foi observado que a supressão da CLP nestas espécies aumenta a sua susceptibilidade a antibióticos tais como linezolida e rifampicina, e diminui a virulência em patógenos tais como Listeria monocytogenes e S. aureus.,23, 33 a perda de virulência nas estirpes com deficiência de ClpXP tem sido associada a perturbações importantes nos níveis globais dos factores transcritionais de virulência, tais como a rede reguladora sar/agr em S. aureus.Curiosamente, o efeito da inactivação da ClpP em vários destes reguladores de virulência parece ser dependente da estirpe e, além disso, algumas estirpes de S. aureus deficientes na função ClpXP parecem ter uma sensibilidade diminuída à vancomicina, Daptomicina e antibióticos β-lactâmicos.,34, 35, 36
Em contraste com a maioria das bactérias, duas ou mais cópias de clpP são encontrados em actinobacteria e cianobactérias e pelo menos uma cópia funcional é essencial para a viabilidade.37, 38 In Mycobacterium tuberculosis, clpP1 and clpP2 form an operon and both genes are essential. Estas isoformas trabalham em conjunto para criar uma protease funcional empilhando ClpP1 e ClpP2 homoheptamers em um heterotetradecamer.37, 39 das quatro AAA+ ATPases em M. tuberculosis, ClpX e ClpC1 são essenciais para a viabilidade.,40, 41
dado o seu papel na viabilidade celular e virulência, o sistema ClpP é um alvo promissor para novos antibacterianos com três mecanismos possíveis de desregulamentação (Figura 2): inibição da proteólise ClpP, activação da proteólise ClpP ou perturbação da AAA+ ATPases parceiras.inibidores da ClpP
inibidores da ClpP
talvez a abordagem mais óbvia para atingir o sistema ClpP seja o desenvolvimento de um inibidor activo da ClpP. A prova de princípio deste modo de acção foi demonstrada em S. aureus, Streptococcus pneumoniae e L., monocytogenes, em que as batidas clpP são incapazes de causar abcessos da pele, infecções pulmonares ou parasitismo macrófago in vivo, respectivamente.22, 42, 43 esta perda de virulência tem sido associada à diminuição da actividade das proteases extracelulares, lipases, DNases e α-hemolisina em S. aureus, e α-listerolisina e fosfolipase listerial em L. monocytogenes.os esforços pioneiros de Böttcher e Sieber44 para atingir o ClpP levaram ao desenvolvimento de uma série de inibidores β-lactona., Inspirados pela reactividade das β-lactonas encontradas na natureza, sintetizaram uma biblioteca de derivados alcinos marcados (por exemplo, lactona D3; figura 3a), que foram rastreados contra vários proteomas bacterianos. Click chemistry on the alkyne tag was used to attach a fluorophore and allow for the identification of reactive enzymes. Desta forma, o ClpP foi identificado como um alvo altamente específico que forma um aduto covalente entre o seu local activo Ser98 e a β-lactona, inibindo assim irreversivelmente a actividade proteolítica (figura 3b).,A caracterização subsequente demonstrou a capacidade das β-lactonas para reduzir a actividade do factor de virulência, incluindo α-hemolisina e listerolisina, em S. aureus e L. Monocytogenes, respectivamente.Esta redução dos factores de virulência correlacionou-se com a capacidade dos andaimes beta-lactonas optimizados (U1; figura 3a) para reduzir significativamente a infecção por S. aureus após administração subcutânea num modelo de abcesso cutâneo e crescimento de L. monocytogenes em macrófagos.46, 47 além disso, os derivados β-lactona (composto 7; Figura 3a) estavam entre o grupo privilegiado de compostos capazes de entrar em M., tuberculose a fim de inibir eficazmente o crescimento com uma MIC de 28 µg ml−1, 48 em última análise, no entanto, a baixa estabilidade plasmática devido à rápida hidrólise do éster Cíclico impede um maior desenvolvimento clínico.
ClpP inibidores. a) estruturas químicas de β-lactonas e ésteres fenílicos altamente activos. β-lactona D3 foi originalmente usada como uma sonda para inibição ClpP por Click chemistry e subsequente otimização rendeu β-lactona U1. β-lactona 7 foi optimizada para M., inibição do crescimento da tuberculose. B) mecanismo de inibição do local activo proteolítico das β-lactonas por modificação covalente do Ser98. A hidrólise do complexo acil-enzimático é descrita pela sua semi-vida. C) comparação da estabilidade, potência e actividade da β-lactona e do éster fenílico. A redução da hemólise refere-se à quantificada pela limpeza das placas de ágar do sangue causada pelas culturas de S. aureus. (ND, não determinado). Uma versão completa desta figura está disponível no Journal of Antibiotics journal online.,mais recentemente, Sieber andgues49 descobriu uma nova classe de inibidores potentes da ClpP, os ésteres fenílicos (AV170; figura 3a). Descoberto utilizando um ecrã imparcial de 137 000 compostos sintéticos num ensaio fluorogénico para a actividade da ClpP, os ésteres fenílicos actuam pela mesma modificação covalente de Ser98 Como β-lactonas., Curiosamente, alguns enantiômeros também são capazes de despoligomerização do tetradecâmero ClpP em heptâmeros, um modo de ação favorável dado que o controle conformacional da tríade catalítica serina o torna inativo na forma heptamérica do ClpP. Apesar da maior potência dos ésteres fenílicos na inibição da protease sobre as β-lactonas, a sua actividade anti-virulência é reduzida, uma vez que só são capazes de diminuir e não abolir a produção de α-hemolisina (figura 3c). Os esforços para aumentar a potência revelaram um compromisso entre estabilidade e reactividade.,Embora a inibição da ClpP mostre a promessa como um mecanismo de acção, é claramente necessário o desenvolvimento e a descoberta de andaimes novos. Além disso,dadas as provas recentes de resistência ao fármaco em certas estirpes knockout da clpP, podem justificar-se algumas precauções nesta via.activadores ClpP activação do sistema de protease ClpP é uma opção terapêutica particularmente intrigante. Uma característica das proteases intracelulares é a regulação rigorosa da actividade para evitar a degradação das proteínas alvo. Em eucariontes, isso é muitas vezes realizado pela compartimentalização em organelas., Em contraste, as bactérias desenvolveram complexos proteicos regulatórios apertados para controlar a actividade da protease. Ativando proteolíticas atividade de forma indiscriminada degradar proteínas, uma droga seria capaz de causar a morte celular, não só nas espécies onde ClpP é essencial, mas também aqueles onde ClpP é dispensável. Mutações abolindo a atividade da ClpP, enquanto teoricamente conferindo resistência, seriam fatais em células onde a ClpP é essencial e prejudicam a virulência em células onde a ClpP é dispensável., Finalmente, o modo de ação sem precedentes por ativação, em vez de inibição do seu alvo, pode permitir que tal droga seja eficaz contra células persianas dormentes.
prova Casual de princípio deste mecanismo de Acção único foi relatada com a descoberta de acildepsipéptidos (ADEPs; figura 4a). ADEPs foram descritas pela primeira vez em uma patente em 1985 como o ‘A54556 complexo,” um grupo de oito intimamente relacionados com compostos produzidos por Streptomyces hawaiiensis NRRL15010.50 ClpP foi identificado como ADEP molecular do destino quando, em 2005, Brotz-Oesterhelt et al.,A genómica reversa aplicada a uma estirpe E. coli resistente a ADEP para identificar o determinante da resistência como uma mutação no ClpP que o torna inactivo. Este achado sugere que os apitos ativam ClpP, causando degradação proteica inapropriada. De facto, estudos in vitro que medem a clivagem de peptídeos fluorogénicos e a análise Proteómica in vivo confirmaram que a substância activada por ADEP B. A substância subtilis ClpP foi capaz de degradar proteínas independentemente da regulação AAA+ ou da hidrólise de ATP.,51
ClpP Ativadores. (a) estrutura Química de produtos naturais ClpP ativadores de ADEP1 e sclerotiamide, e o otimizado sintético ClpP ativador ACP1b. (b) a estrutura de Cristal de E. coli ClpP tetradecamer no complexo com a ADEP (PDB 3MT6)55 Empilhamento heptamers são mostrados na luz/escuro cores, ClpP monômeros são mostrados na alternando vermelho e azul, e ADEP moléculas são mostrados em verde., c) estruturas representativas da RAE do ADEP que culminem em vários esforços de Química medicinal. Os microfones contra S. aureus estão listados.54 (d) local de acoplagem de apé na interface de dois monómeros ClpP, apresentados em rosa claro/azul. Os nitrogénios são marcados em azul escuro, enquanto os oxígenos são marcados em vermelho. Duas ligações transanulares h reportadas são mostradas por linhas amarelas tracejadas. Uma versão completa desta figura está disponível no Journal of Antibiotics journal online.,
Visão sobre esta perda de regulamento foi fornecida por estruturas cristalinas da ADEP-ativado ClpP de E. coli, B. subtilis, o M. tuberculosis e Neisseria meningitidis (Figura 4b).52, 53, 54, 55 uma molécula de ADEP liga-se a cada monómero no tetradecâmero ClpP no mesmo bolso hidrofóbico que é usado pelas ATPases AAA+, inibindo assim a sua interacção (figura 4d).,52, 55, 56 ligantes imitam o controle conformacional da ATPase do ClpP, induzindo o alinhamento da tríade catalítica serina e uma rotação rígida do corpo dos monômeros ClpP, alargando o poro axial de 10-12 Å para 20 Å em E. coli.27, 52, 55 um mecanismo de gating também é fornecido pelos domínios N-terminal, que se movem de uma conformação para baixo, ou fechada para um up, ou conformação aberta na ligação de ADEP.,A ativação do ADEP 52, 55 não permite que proteínas dobradas estavelmente sejam degradadas, pois ainda são muito grandes para entrar no lúmen axial do ClpP, mas permite que proteínas instáveis e cadeias nascentes que emergem do ribossoma sejam degradadas, especialmente se dobrarem lentamente.Acredita-se que a morte celular seja um resultado desta degradação indiscriminada, bem como a inibição da função ClpP normal.os ADEPs são activos contra uma gama de bactérias Gram-positivas incluindo S. aureus resistentes à meticilina (MRSA), enterococos resistentes à vancomicina e S. resistentes à penicilina., pneumoniae, as well as the Gram-negative pathogenesis N. meningitidis and Neisseria gonorrheae.Os derivados semissintéticos do ADEP são eficazes contra Enterococcus faecalis,S. aureus e S. pneumoniae em modelos de ratinho e rato com actividade superior à linezolida, 51 e a actividade contra a MRSA num modelo de periotinite murina é superior à vancomicina.58 notavelmente, a resistência aos ADEPs se desenvolve em uma frequência tão alta quanto 10-6 nestas espécies bacterianas por mutações diminuindo a função de ClpP, que é não-essencial., No entanto, utilizando a diminuição da aptidão dos mutantes clpP como uma vantagem, as terapêuticas combinadas de ADEP e rifampicina demonstraram erradicar completamente uma população de MRSA resistente à vancomicina in vitro.Ainda mais promissora é a capacidade dos apitos para eliminar células persianas.59 Conlon et al.A primeira descrição desta propriedade foi feita quando um ADEP matou efectivamente tanto a fase estacionária S. aureus como persister S. aureus após o tratamento com ciprofloxacina. Este achado tem implicações para o uso de ADEPs contra infecções latentes de tuberculose causadas por M. persistents tolerantes ao fármaco., Até à data, a actividade contra M. persisters não foi descrita, mas foi demonstrado que os apitos diminuem o crescimento da M. tuberculosis quando combinados com dois inibidores da bomba de efluxo, a reserpina e o verapamilo.Embora os ADEPs sejam pistas promissoras para os candidatos à droga, têm propriedades farmacológicas desfavoráveis, incluindo uma fraca solubilidade na água, uma rápida depuração sistémica e instabilidade química.51, 60 após a descoberta do modo de Acção do ADEPs, foi lançado pela Bayer AG um programa de química farmacêutica SAR para desenvolver um derivado mais estável e potente do ADEP., Esse esforço resultou no desenvolvimento de ADEP4, altamente potente ADEP1 derivados com três importantes modificações: Phe é substituído por 3,5-difluorophenylalanine, que é pensado para formar H laços com ClpP, o acyl polyene é substituído por uma α,β-insaturados hexenoyl cauda para melhorar a estabilidade e a N-MeAla é substituído por pipecolate, o que aumenta a ADEP da rigidez.A actividade do ADEP4 foi ainda melhorada por Carney et al.61 por substituição de Ser por Allo-Thr e Pip por 4-MePip para rigidificar ainda mais o ADEP., Ao quantificar as taxas de câmbio de hidrogênio-deutério usando 1H NMR, a rigidificação da molécula de ADEP foi mostrada para fortalecer as ligações transanulares H, reduzindo assim os custos entrópicos de ligação ao ClpP. O derivado do ADEP de Carney tem 600-1200 vezes maior potência do que o ADEP1 contra patógenos Gram-positivos.Apesar da potência aumentada destes derivados do ADEP, eles ainda têm actividade limitada contra bactérias Gram-negativas e são eficazmente removidos da célula por efluxo activo, especialmente em M. tuberculosis.,39, 62 inúmeros outros esforços de química sintética têm explorado motivos para superar essas limitações, mas a maioria resultou em diminuição da atividade (figura 4c).54, 63, 64, 65, 66, 67 dada a ligação íntima de ADEP em seu bolso hidrofóbico, este resultado é talvez previsível e sugere que a modificação no cadafalso de ADEP pode ter alcançado um impasse.foram montados dois ecrãs de alta capacidade para identificar novos activadores ClpP.65, 68 ambos identificaram activadores de moléculas pequenas de E., coli ClpP por meio de um ensaio in vitro que mede aumentos de fluorescência causados pela clivagem da isotiocianato–caseína fluoresceína, um substrato modelo para a ClpP. No primeiro, Leung et al.60 000 substâncias químicas sintéticas tipo fármaco, identificando cinco compostos denominados ACP1-5 (Figura 4a). Os compostos mais activos eram 10 a 20 vezes menos potentes do que o ADEP1 na activação do ClpP e apresentavam apenas actividade antibacteriana modesta, mesmo na presença de agentes permeabilizantes. Lavey et al.,Em vez disso, foi rastreado >20 450 extractos ou metabolitos fúngicos e bacterianos e identificou um único activador ClpP, a esclerotiamida (figura 4a). Esta indolinona relacionada com paraherquamida foi 73 vezes menos potente do que o ADEP1 na activação do EcClpP e não inibiu o crescimento de E. coli com insuficiência de efluxo ou Pseudomonas aeruginosa.apesar da eficácia limitada das ACPs e da esclerotiamida, estes estudos fornecem novos suportes para derivação e abrem a porta a futuros estudos para identificar activadores ClpP., Pode-se imaginar, por exemplo, a identificação de locais alternativos de ligação de ativação no ClpP. O regulamento do ClpP envolve não só o controle da entrada do substrato por alargamento de poros em associação AAA+ ATPase, mas também a formação do local catalítico Serino através da oligomerização em tetradecamers.69 talvez uma pequena molécula que induziu a formação activa do local, mantendo o ClpP como um heptâmero, pudesse permitir um acesso fácil a este local activo por substratos indiscriminados.,
AAA+ ATPase uncouplers como terapêutica
Como ClpP depende AAA+ ATPases para selecionar e desdobrar proteínas substratos, perturbação esses parceiros também podem desregular a ClpP proteolíticas do sistema. Em particular, isto aplica-se ao M. tuberculosis, onde as ATPases ClpC1 e ClpX são essenciais para a viabilidade celular.40, 41 De facto, cada um dos três compostos que visavam o ClpC1 caracterizado até à data foram descobertos através do rastreio de extractos de produtos naturais para a actividade anti-M. da tuberculose., O primeiro destes a ser descoberto é ciclomarina A (cymA), um heptapéptido Cíclico produzido pela bactéria marinha Streptomyces sp. CNB-982 (figura 5a).Apesar de ter sido descrito em 1999 como um potente agente anti-inflamatório com citotoxicidade contra as células cancerígenas, não foi até 2011 que a actividade contra M. tuberculosis foi descoberta durante uma tela natural de células inteiras do produto.71 numa primeira tentativa de identificar o alvo molecular da cymA, foi adoptada uma abordagem genómica reversa. No entanto, após a ausência de Resistência espontânea M., mutantes da tuberculose podem ser recuperados, cromatografia de afinidade foi usado em vez de mostrar que cymA alvos ClpC1 com alta especificidade. A co-cristalização subsequente do cymA com o domínio N-terminal do ClpC1 identificou resíduos importantes para a ligação e, apesar da incapacidade de gerar mutantes resistentes espontâneos, permitiu a criação de mutantes ClpC1 que conferiam resistência ao cymA.72
ClpC1 Ativadores. a) estruturas químicas de cymA, ecumicina e lassomicina., Os aminoácidos básicos são mostrados em vermelho, e alifáticos / aromáticos são mostrados em azul. b) estrutura cristalina do domínio N-terminal de M. tuberculosis do CLPC1 (PDB 3WDC). Os diferentes locais de ligação de cada activador são demonstrados pelos resíduos de localização envolvidos na ligação do activador, apresentados em amarelo (lassomicina), azul (ciclomarina) e vermelho (ecumicina). Uma versão completa desta figura está disponível no Journal of Antibiotics journal online.
em 2014, ecumicina, um tridecapéptido macrocíclico de Nonomuraea sp., MJM5123, 73 and lassomicina, a 16-membered lasso-peptide from Lentzea kentuckyensis sp., 74 foram isolados por rastreio de extractos de actinomicetes brutos (figura 5a). O domínio N-terminal do ClpC1 foi identificado como o alvo molecular destes compostos por genómica reversa em mutantes resistentes espontâneos. Apesar da cymA, a ecumicina e a lassomicina partilharem um alvo comum, a caracterização estrutural e a posição das mutações que conferem resistência a cada composto sugerem que cada ligação a uma posição ligeiramente diferente no domínio N-terminal do ClpC1 (figura 5b)., Por exemplo, em contraste com cymA e ecumicin, lassomycin é altamente básico, contendo vários Arg resíduos, e docks em um ambiente altamente ácido região de ClpC1.74
CymA, ecumicin e lassomycin são todos bactericida contra replicação de M. tuberculosis, uma gama de outras espécies micobacterianas, e multidroga-resistentes de M. tuberculosis. O que é importante é que também são activos contra a tuberculose M. não falsificadora. Consistente com a falta de essencialidade da AAA+ ATPases, cada uma carece de atividade contra outras espécies Gram-positivas e Gram-negativas como S. aureus e P. aeruginosa., Esta especificidade tem benefícios, uma vez que também lhes falta actividade contra os membros Comensais da microbiota humana.para causar a morte celular em M. tuberculose, a ecumicina e a lassomicina parecem estimular a actividade da ATPase, mas dissociá-la da degradação das proteínas.73, 74 desta forma, a degradação dos substratos naturais é inibida e leva ao seu acúmulo e toxicidade, semelhante às ações de inibidores e ativadores ClpP em M. tuberculosis., Em contraste com ecumicin e lassomycin, cymA tem sido sugerido para aumentar a degradação de proteínas, como demonstrado por uma diminuição LeuAspAsp tripeptídeo-tagged proteína verde fluorescente fluorescência direcionados para ClpC1 em incubação com cymA.71 no entanto, é possível que esta diminuição da fluorescência seja o resultado de uma proteína fluorescente verde que se desenrola por ClpC1 em vez de degradação, pelo que a cymA pode ter o mesmo mecanismo de desengate que a ecumicina e a lassomicina., Várias questões permanecem sem resposta sobre o mecanismo de ação dessas drogas, incluindo seus efeitos no desenvolvimento de proteínas e como a atividade da ATPase é estimulada e a proteólise inibida, por exemplo, inibindo a interação com o ClpP1P2. Além disso, a caracterização ainda está em andamento para mais um inibidor ClpC1 recentemente descoberto, a rufomicina analógica RUF-I. 75
apesar da potência relativamente elevada de cymA, ecumicina e lassomicina contra a M. tuberculose, a otimização das propriedades farmacológicas é necessária., Por exemplo, a cymA apresenta uma depuração hepática e uma semi-vida curta em ratinhos, e a ecumicina tem uma solubilidade limitada e uma fraca absorção intestinal.13, 73 sínteses totais recentes e otimização da fermentação podem ajudar nestes desenvolvimentos.76, 77, 78
embora os medicamentos que visam a ClpC1 sejam uma possibilidade intrigante para os terapeutas da tuberculose anti-m., geralmente não têm actividade bactericida contra espécies que não as actinobactérias., Nestas espécies em que ClpP e AAA+ ATPases associadas são dispensáveis, é possível que o alvo destas ATPases teria efeitos antivirulentos semelhantes aos observados com inibidores da ClpP. No entanto, tal composto teria provavelmente de ser capaz de atingir múltiplos parceiros ATPase, a fim de ter um efeito tão generalizado como a ação direta no ClpP. Estes potenciais efeitos antivirulentos não foram investigados para a cymA, lassomicina ou ecumicina.,
alcançando a especificidade
dos complexos proteolíticos bacterianos, todos, exceto HslUV tem um ortolog humano e muitos são de fato intensamente estudados como potenciais alvos anticancerígenos. Por exemplo, proteases mitocondriais LONP1, ClpXP e m-AAA (FtsH homolog) têm papéis importantes no controle de qualidade nas mitocôndrias, especialmente durante o estresse respiratório.79 mutações em M-AAA também estão implicadas em paraplegia espástica, uma doença neurodegenerativa hereditária.80 como tal, é vital que os agentes antimicrobianos sejam capazes de atingir o seu homolog bacteriano especificamente.,no caso dos inibidores da protease que pretendem actuar como substratos suicidas, atingir a especificidade pode ser um desafio, devido aos mecanismos catalíticos conservados. De facto, foi encontrada uma falta de especificidade nos esforços para desenvolver inibidores tanto do proteosoma procariótico como da protease bacteriana. Os procariontes proteassoma em M. tuberculosis torna um alvo promissor para a inibição, como ele é dispensável para o crescimento in vitro, mas é essencial para a sobrevivência de óxido nítrico stress81 e persistência em ratos.,62, 82, Muitas tentativas têm sido feitas para desenvolver um medicamento contra o micobacterianas proteassoma, geralmente como peptidyl epoxyketones, aldeídos ou boronates, mas a maioria inibir o mamífero proteassoma mais potente do que a de M. tuberculosis.No entanto, a selectividade não é inédita, como demonstrado pela descoberta dos compostos oxatiazole-2-ona GL5 e HT1171 (Figura 6). Estes compostos são bactericidas contra M., tuberculose tratada com níveis subinibitórios de oxido21 nítrico e com >1000 vezes maior actividade contra micobacterianos sobre proteosomas humanos. Pensa-se que a especificidade é conferida pela interacção do fármaco com resíduos fora do local activo não conservados em proteosomas de mamíferos.21
M. tuberculosis inibidores do proteassoma do oxathiazole-2-uma família.,
Lon também faz para um alvo promissor, como tem sido implicado na formação de biofilme, a mobilidade e a tolerância ao estresse, e mutantes têm sido mostrados para ter reduzido a colonização e a virulência de Salmonella enterica sorovar Typhimurium, Actinobacillus pleuropneuoniae, Vibrião da cólera e P. aeruginosa.84, 85, 86, 87 no único esforço até à data para identificar inibidores bacterianos da Ion, os inibidores do proteosoma foram rastreados in vitro e o boronato de peptidilo MG262 foi identificado.,18 no entanto, este composto ainda é 2000 vezes mais potente contra o PROTEOSOMA 20.Tal como acontece com os compostos oxatiazole-2-ona, é provável que a utilização de resíduos divergentes nos homólogos humanos seja necessária para desenvolver um inibidor altamente específico da Ion.
a especificidade também pode ser alcançada movendo-se para fora do local catalítico activo para locais de ligação que perturb função da protease, mas são pouco conservadas entre humanos e bactérias ortólogos. Os projectos demonstram adequadamente o potencial desta abordagem., Embora não tenham sido testados diretamente em ClpP humana (hClpP), os ADEPs não são tóxicos para as células humanas até 25 µg ml-1, sugerindo que eles têm afinidade pobre, se houver, para a enzima humana.58 a comparação estrutural de E. coli (EcClpP) e hClpP suporta esta noção. Sua estrutura de espinha dorsal é amplamente conservada, com um desvio quadrático médio de 0.,63 Å;88 no entanto, a inspeção do bolso hidrofóbico usado para ADEP ligação mostra que hClpP tem várias substituições de reduzir a sua hidrofobicidade (Asn55Pro, His60Tyr e His112Phe) junto com uma carga de inversão (Glu56Lys) na porção distal do encaixe do groove. É bem possível que estas alterações evitem a ligação de ADEP em hClpP. Deve-se notar, no entanto, que EcClpX, embora não EcClpA, pode ativar hClpP.88 em qualquer caso, a procura de drogas ligando locais regulatórios menos conservados pode ser a chave para encontrar antibacterianos altamente específicos.